肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）严重威胁人们的身体健康，据世界卫生组织最新预测，到2030年将有100万人死于HCC。对于晚期HCC患者，治愈和长期生存前景仍十分暗淡[1, 2]。尽管近年来出现了针对PD-1或PD-L1的免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitors，ICIs）在HCC患者中显示出部分疗效，但其总体临床有效率仍然很低，仅占HCC患者的20%左右 [3]。研究表明，HCC中Wnt/β-catenin信号通路的激活促进了肿瘤免疫逃逸和抗PD-1/PD-L1免疫治疗耐药，这与HCC的低临床获益显著相关 [4-7]。因此，开发一种能够靶向调控Wnt/β-catenin信号通路并联合ICIs阻断治疗的药物，以优化HCC的免疫治疗是迫切需要的。报道了一种同时靶向β-catenin和PD-L1可用于增强肝细胞癌的免疫治疗的球形外消旋超分子多肽，具有良好的HCC疗效和生物安全性，为HCC免疫治疗提供了新策略与思路。
在此项研究中，研究者通过层级自组装的方式，合成了一种命名为sBBI&PDP的外消旋超分子多肽（图1），主要由BCL9/β-catenin抑制剂的L型肽（Inhibitor of BCL9 / β-catenin，sBBI)和PD-1/PD-L1抑制剂的D型肽（PD-L1 predator，PDP）构建而成。
图1 sBBI&PDP的设计与合成
肿瘤细胞中高浓度的谷胱甘肽（Glutathione，GSH）可触发金纳米颗粒表面硫醇的释放 [8, 9]。在10 mM GSH环境下，sBBI&PDP的TEM颗粒直径和水合粒径显著变小，表明sBBI&PDP多肽发生了释放（图2A-B）。图2C高效液相色谱（HPLC）结果也显示，在PBS缓冲液（No GSH）中，24h内未检测到明显的肽吸收峰，sBBI&PDP保持稳定，而在10 mM GSH溶液中，可以观察到多肽的快速释放。此外，电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）结果（图2D）显示，sBBI&PDP在生物体内的半衰期为8.5 h，1周后，大部分sBBI&PD纳米颗粒代谢出体外，仅肝、脾少量残留，说明sBBI&PDP是经单核巨噬细胞系统并可被机体清除的纳米颗粒。
图2 sBBI&PDP的释放和药物代谢动力学
为探索sBBI&PDP在体内的抗肿瘤机制（图3），研究者通过建立同种原位肝癌小鼠模型，对治疗后的肝癌组织行蛋白质组学（Label-free）测序分析，发现sBBI&PDP与Control（生理盐水）和商品化PD-L1抑制剂（Anti-PD-L1）相比，存在大量的差异蛋白表达。进一步基因富集分析（GSEA）显示，与Control或Anti-PD-L1组相比，sBBI&PDP组的Wnt-β/catenin信号通路显著下调，对应的HCC组织β-catenin和CyclinD1的免疫组化结果与GSEA分析一致，在sBBI&PDP组显著下调。更重要的是，sBBI&PDP处理组的HCC组织在激活免疫反应相关T细胞方面显著上调。相应的免疫荧光双染色（IF）结果显示，CD3+/CD8+ T细胞显著上调，CD4+/CD25+ T细胞显著下调。以上表明sBBI&PDP在体内可以募集更多的CD8+ T细胞作用于HCC组织，并通过抑制Wnt/β-catenin和PD-L1增加CD8+ T细胞对HCC肿瘤的杀伤敏感性。
图3 sBBI&PDP在体内的抗肿瘤机制
为验证sBBI&PDP对肝癌的治疗作用，作者通过建立同种原位肝癌移植小鼠模型研究其疗效（图4）。sBBI&PDP给药期间对小鼠体重变化无显著差异，给药结束后的肝肿瘤照片照片对比，sBBI&PDP组的肿瘤结节数量显著更少或消失。对肝癌组织切片的HE染色和TUNEL染色分析，发现sBBI&PDP组的肿瘤坏死区域和凋亡细胞更多，PD-L1蛋白的IHC分析也显著下调。在3个月的Kaplan-Meier生存分析中，与sBBI、Anti-PD-L1、Au纳米颗粒或Control组相比，sBBI&PDP组HCC荷瘤小鼠的生存时间更久，中位生存时间分别为80天、55天、53天、41天和39天（p = 0.0058）。
图4 sBBI&PDP在同种原位肝癌小鼠中的抗肿瘤疗效探索
图5 sBBI&PDP 在肝癌细胞中的作用机制示意图
sBBI&PDP通过EPR效应和肿瘤酸性pH响应靶向肿瘤细胞，释放BBI多肽抑制肿瘤细胞中β-catenin和BCL9相互作用，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，阻止肿瘤细胞的增殖，另外还可促进CD8+ T细胞浸润，增敏HCC免疫治疗；另一方面，释放PDP与肿瘤细胞PD-L1胞内段结合，阻断T细胞PD-1/PD-L1相互作用，缓解免疫耐受，增强CD8+T细胞杀伤肿瘤细胞效应（图5）。与单独sBBI、商品化PD-L1抑制剂或Wnt抑制剂相比，sBBI&PDP在C57小鼠同种原位HCC模型和人源免疫NSG小鼠肝癌异种移植瘤（HCC-PDX）模型中显示出更优的抗肿瘤效果。此外，sBBI&PDP还保持十分良好的生物组织相容性。
