胆管癌是仅次于肝细胞癌的第二常见原发性肝癌[1]。晚期胆管癌预后差，姑息性化疗的临床获益有限，靶向治疗和免疫检查点抗体治疗取得了一定进展，但仍不尽如人意[2]。嵌合抗原受体T (Chimeric antigen receptor-T, CAR-T)细胞在血液肿瘤中已经取得显著疗效[3，4]，但是实体瘤中多种因素造成的高度免疫抑制微该研究基于胆管癌免疫抑制微环境特异性改造CAR-T细胞，增强其抗胆管癌活性，提供一种更高效的免疫细胞治疗胆管癌方法。

该研究在胆管癌患者的肿瘤组织中发现胆管癌细胞的EGFR和B7-H3均有高丰度的表达，随后分别构建了靶向EGFR和B7-H3抗原的EGFR-CAR-T和B7H3-CAR-T细胞。通过LDH释放测定，EGFR-CAR-T细胞和B7H3-CAR-T细胞对胆管癌细胞系TFK-1和HuCCT1均表现出剂量依赖性和特异性的细胞毒性（图1）。

图1 EGFR-CAR-T细胞和B7H3-CAR-T细胞在体外胆管癌细胞株的抗肿瘤活性检测

恶性肿瘤的免疫微环境是高度异质性的。为了特异性筛选胆管癌中浸润T细胞表达的免疫检查点，该研究用流式细胞术检测了PD-1、Tim-3、Lag3、Tigit、BTLA、CTLA4、CD244、CD160等免疫检查点在胆管癌组织中的表达量。经肿瘤组织、癌旁组织、周围正常组织的配对分析显示，PD-1、Tigit和Tim-3是丰度最高的三个免疫检查点。此外，胆管癌的免疫图谱表征表明，高度丰富的免疫抑制分子TGFβ、IL-10和IL-6通过激活肿瘤浸润T细胞上相应的受体诱导其功能障碍并介导肿瘤逃逸[7, 8]。因此，研究者进一步是降低CAR-T细胞上的TGFβ、IL-10和IL-6受体的表达来阻断其介导的免疫抑制，构建PTG-T16R-scFV-CAR-T细胞。LDH检测结果显示，PTG-T16R-EGFR-CAR-T细胞体外抗肿瘤活性最高，修饰后的B7H3-CAR-T细胞也产生了类似的结果。这些结果表明，PTG-T16R-scFV-CAR-T细胞在体外表现出强大的抗肿瘤活性（图2）。

图2 PTG-T16R-scFV-CAR-T细胞在体外胆管癌细胞株模型的抗肿瘤活性监检测

类器官是通过三维培养技术制备的人工器官模型，能够最大程度地模拟体内组织结构及功能。该研究通过建立胆管癌类器官，进一步评估PTG-T16R-scFV-CAR-T细胞的抗肿瘤能力。利用实时生物技术成像系统监测CAR-T细胞与胆管癌类器官的共培养系统，结果显示PTG-B7H3-CAR-T细胞比B7H3-CAR-T细胞具有更强的抗肿瘤活性，PTG-T16R-B7H3-CAR-T细胞表现出最有效的肿瘤杀伤能力，包围类器官并在类器官中心引起更大的凋亡区域。共培养24 h后的流式细胞分析也同样表明，PTG-T16R-B7H3-CAR-T细胞介导肿瘤凋亡能力最强（图3）。

图3 PTG-T16R-scFV-CAR-T细胞在体外胆管癌类器官模型的抗肿瘤活性检测

接着，研究者进一步建立了人源化小鼠胆管癌模型验证PTG-T16R-scFV-CAR-T细胞的体内抗肿瘤效应。结果表明，PTG-T16R-EGFR-CAR-T细胞在控制肿瘤生长上具有明显优势。同时PTG-T16R-EGFR-CAR-T组的肿瘤浸润CAR-T细胞也显著增加，并产生更高水平的IFN-γ。此外，研究者发现PTG-T16R-EGFR-CAR-T组脾脏的中枢记忆CAR-T细胞比例也明显增加，表明PTG-T16R-EGFR-CAR-T细胞具有更高的归巢能力和记忆持久性，这使得它们能够在体内存活更长时间，并实现长期的抗肿瘤作用。同时PTG-T16R-B7H3-CAR-T细胞也展现出优越的体内抗肿瘤活性。这些结果表明PTG-T16R-scFV-CAR-T细胞在体内也具有强大的抗肿瘤活性（图4）。

图4 PTG-T16R-scFV-CAR-T细胞在体内模型的抗肿瘤活性检测

图5 CAR-T细胞的改造模式图