肾脏纤维化是慢性肾脏病发展过程中的必经途径。肾脏纤维化的发病机制多样，涉及信号通路广泛，迄今为之仍无有效的治疗方法。铜是生物体内重要的微量金属元素，参与细胞的氧化还原反应、能量代谢等生物过程。近年来研究表明铜的积累与纤维化有关。此前研究首次报道CTR1高表达导致的细胞内铜超载首可以促进肾纤维化，铜螯合剂治疗可改善肾脏纤维化[1]（余晨教授团队发表）。
线粒体不仅是重要的铜储库，而且还是细胞内主要的铜利用细胞器。由于肾小管细胞需要大量ATP来维持体液和酸碱平衡，因此肾脏富含线粒体。既往研究表明凋亡的小管上皮细胞可以通过旁分泌促纤维化因子或者通过免疫应答反应促进肾脏纤维化。细胞凋亡分为内源性途径和外源性途径，线粒体在细胞内源性凋亡过程中发挥核心作用。肾小管上皮细胞线粒体内铜过载与线粒体功能、细胞凋亡及肾脏纤维化的关系未见报道，线粒体内铜稳态作用及调控机制有待阐明。该研究着眼于线粒体内铜离子过载介导的线粒体损伤，阐明致纤维化条件下线粒体内铜离子蓄积通过抑制呼吸链复合物IV活性，参与线粒体结构功能损伤、细胞凋亡和肾脏纤维化的具体分子机制。同时，该研究探索了高表达的铜转运蛋白COX17缓解线粒体内过载的重要作用，拓宽了对肾脏纤维化早期代偿机制的认识。
为了确定在肾纤维化时负责调节细胞内铜稳态的基因，该研究首先分析了CKD患者肾活检样本的转录组RNA测序结果。结果显示，铜伴侣蛋白COX17在重度纤维化肾穿样本中表达显著增加（图1a），且与小管间质纤维化程度呈正相关（图1b-c）。进一步通过与线粒体标记物TOM20共染色，发现COX17主要在线粒体内高表达（图1d）。此外，COX17在单侧输尿管结扎第3天（UUO 3d）高表达，并与纤维化模型的胶原沉积成正相关（图1e）。COX17在UUO 14d肾脏纤维化模型和TGF-β1处理的NRK-52E细胞线粒体中高表达（图1f-j）。由此可见，COX17在肾脏纤维化模型线粒体内高表达。
图1. 肾间质纤维化模型中COX17高表达
（图源：Saiya Zhu.et al., APS, 2023）
线粒体在细胞凋亡中起着至关重要的作用，线粒体功能障碍会导致细胞凋亡[2]，从而直接或间接促进纤维化结果[3]。为了探索COX17在线粒体功能障碍、细胞凋亡和肾脏纤维化中的作用，作者通过AAV9-shCOX17下降COX17的表达（图2a-b）。结果发现敲减COX17加剧UUO模型的肾小管细胞线粒体肿胀、结构紊乱；降低ATP水平（图2c-d）。敲减COX17增加肾脏纤维化模型的TUNEL阳性细胞和cleaved caspase 3/9的表达；加剧胶原沉积；减少血清肌酐和尿素氮水平（图2e-n）。这些结果表明：COX17在缓解肾脏纤维化进展中发挥重要作用。
图2. 体内下调COX17加剧肾脏纤维化
（图源：Saiya Zhu.et al., APS, 2023）
为了进一步研究COX17对线粒体功能和细胞凋亡的作用，作者构建了敲减COX17的稳转株，并对其进行TGF-β1处理。结果显示，敲减COX17加剧TGF-β1诱导的线粒体结构的损伤（图3a-c）。敲减COX17降低细胞内ATP水平，增加线粒体ROS产生（图3d-e），敲减COX17还显著增加了cleaved caspase 3/9、胶原I和α-SMA的表达（图3f-g）。
图3.下调COX17加剧TGF-β1引起的线粒体功能障碍和细胞凋亡
（图源：Saiya Zhu.et al., APS, 2023）
接下来，该研究探索了过表达COX17是否可以改善线粒体功能和细胞凋亡。结果显示，过表达COX17改善TGF-β1诱导的线粒体萎缩（图4a-c），增加了细胞内ATP含量，并减少了线粒体ROS的产生（图4d-e）。并且，过表达COX17减轻了cleaved caspase 3/ 9、胶原I和α-SMA的表达（图4f-g）。以上结果表明过表达COX17减轻TGF-β1诱导的线粒体功能障碍、细胞凋亡和纤维化改变。
图4.过表达COX17减轻TGF-β1引起的线粒体功能障碍和细胞凋亡
（图源：Saiya Zhu.et al., APS, 2023）
既往研究发现，细胞内铜离子蓄积促进肾脏纤维化进展[9]。该研究进一步检测了线粒体、胞浆内铜离子含量，发现纤维化模型线粒体内铜离子蓄积，胞浆里铜含量无明显变化（图5a-b）。进一步验证COX17对线粒体内铜离子的调控作用，结果显示过表达COX17减少线粒体铜蓄积，敲减COX17加剧线粒体内铜积累（图5c-d）。线粒体呼吸链复合物IV是线粒体内膜上唯一的铜辅酶，该研究发现过表达COX17恢复TGF-β1引起的复合物IV活性的下降，无法恢复复合物III的活性（图5e-f）。敲减COX17加剧了复合物IV活性的抑制（图5g）。进一步使用分子动力学（MD）模拟探究铜离子过载对复合物IV活性的影响。结果发现，复合物IV亚基1（COX1）铜超载系统中，铜离子发生逃逸。增多的铜离子增强了复合物IV亚基1局部正电荷，减少活性位点铜离子逃逸的位阻（图5h-j）。与COX1类似，COX2铜超载系统也发生了铜离子逃逸，增多的铜离子使铜离子结合位点的氨基酸发生位移，导致结合位点开放（图5k-l）。这些结果提示线粒体内增多的铜离子会抑制呼吸链复合物IV活性，高表达的COX17可能通过减轻线粒体铜过载来恢复呼吸链复合物IV的活性。
图5. COX17减轻线粒体铜蓄积并且恢复呼吸链复合物IV活性
（图源：Saiya Zhu.et al., APS, 2023）
该研究还在体内构建UUO模型，给予TM干预以及体外利用TGF-β1处理肾小管上皮细胞，给予TM干预。通过检测线粒体功能、凋亡指标以及纤维化指标变化情况，进一步验证了线粒体内铜离子过载会引起线粒体功能障碍、细胞凋亡及肾脏纤维化。
