前言

WB，是Western blotting的缩写，即蛋白质印迹法，又称免疫印迹（immunoblotting）,也就通过电泳技术分离不同组分，再采用印迹技术将蛋白质转移（“印”）到特定的膜上，再利用抗原-抗体的特异性结合原理，用抗体作为探针去实现检测复杂样品中的靶标蛋白的方法，这项技术也可以用来检测不同时期蛋白表达的水平以及蛋白相互作用等方面。

在实际操作中，菌菌发现大多数初进实验室的小白最开始兴致勃勃准备大干一场，但在导师的带领下简单操作了一遍WB后，就很容易陷进一个误区：不需要弄懂WB原理，只用按照SOP做，一样可以把实验做成功。可事实真是这样的吗？原理真的不会影响到实操吗？下面菌菌就为你揭秘。

 

WB由来

1975年，英国人Edwin Mellor Southern发明了基因组DNA特定序列定位的方法：

将待测定DNA分子从琼脂糖凝胶中转移到一定的固相支持物硝酸纤维素膜（NC膜）上，即印迹（blotting），然后膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下杂交，检测特定DNA片段，并将这种方法命名为Southern印迹法；后来Alwine又用类似方法检测RNA，正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交；1981年Burette成功将对单向电泳分离后的蛋白质分子转印到膜上并进行免疫学分析（如抗体抗原特异性结合），这种印迹分析称为Western印迹法；而Eastern blotting是Western blotting的变形，只是检测对象变成了双向电泳后的蛋白质分子（所谓的双向电泳是等电聚焦-聚丙烯酰胺凝胶电泳（IEF-PAGE）分离蛋白质）。

 

实验原理

WB实验是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）将混合蛋白质样品分离后，利用特殊虹吸或电场装置印迹至与相对应的第一抗体特异性结合，之后再与酶或同位素标记的第二抗体相结合，最终通过底物显色或放射自显影来检测特异性目的基因表达的蛋白成分。Western Blotting先使用PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）电泳分离出待检测的蛋白质，再用电场装置印迹至固相介质（如PVDF膜）上，固相介质以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及生物学活性不变。再以膜上的蛋白质片段作为抗原，与一抗（“探针”）特异性结合起免疫反应，再与酶或同位素标记标记的二抗结合，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

 

实验流程

SDS-PAGE凝胶电泳：

（1）分离胶

①配制：

根据蛋白分子量大小确定合适的凝胶浓度后，可参考凝胶配置试剂盒中的说明书（如目标GFP蛋白为25kDa，采用8%-16%梯度浓度的胶），或自行参考文献配置。依次加入所需试剂于配胶专用烧杯中，轻轻并缓慢吹打胶溶液以混匀，用移液枪吸取液体和打出液体速度应至少保持在2-3s左右。注意：放液时不能全部放出，否则容易产生气泡，影响实验结果（有气泡的地方不导电）；配胶的APS需要在4℃的冰箱中保存；胶在加APS与TEMED促凝剂前一定要混匀其他组分。

 

电泳凝胶制备参考浓度

②灌胶：

配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀就可开始灌胶。灌胶时，可用移液枪吸取胶沿玻璃板壁缓缓放出注入胶室，待胶面升到绿带中间线高度时即可。再次强调注意控制速度，避免气泡。然后加入适当剂量的纯水或无水乙醇以封胶，以盖住分离胶为准。

③凝胶：

在室温下开始凝胶30min。注意：凝胶过程中胶板应当保持稳定，不可晃动，否则导致分离胶液面不平。

④倒压胶液：

当压胶液和分离胶之间有一条折射线时，说明胶已大致凝固。再等大约3min，胶就充分凝固。此时将压胶液倒入废液缸，并用吸水纸伸入两板间的胶室将残留的压胶液吸干，但要注意别碰到分离胶表面。

 

（2）浓缩胶

①配制：与分离胶操作一致，只是所需试剂不同。

②灌胶：配4％的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀灌胶。灌胶操作参考分离胶灌胶。

③插样品梳：灌胶后立即将样品梳缓慢插入凝胶中，样品梳插入后应与胶板保持平行，不应倾斜。

④凝胶：大约20min浓缩胶凝固，双手用食指与拇指捏住梳子，缓慢轻轻竖直向上拔出梳子，切记不要拔歪，保证齿口整齐。

 

（3）电泳

将胶板放入电泳槽中，并加入1×Tris-甘氨酸或SDS电泳缓冲液，入足量的样品和合适的蛋白marker。电泳槽连接电泳仪。上槽接负极,下槽接正极，通电起始电压80V，10min后100V，电泳2h或当溴酚蓝迁移至离底部1cm时，停止电泳。注意不能让溴酚蓝跑出去。

 

转膜

转膜指的是把蛋白从凝胶转移至特定材质的膜上，我们本次采用PVDF膜，不同膜的性质不同，具体详情参考表2。

依据胶的大小裁剪膜和滤纸6张，置于缓冲液中平衡10min。PVDF膜则需用纯甲醇浸泡湿润1-2s。采用“湿转移”，即把“三明治”黑板-海绵-3层滤纸-胶-膜(正面朝下，分清左右，与胶对应)-3层滤纸-海绵-白板依次放好，并完全浸入缓冲液中湿透操作（注意：黑色板的一面对黑色负极，湿转过程中不能干，轻轻用刮板赶走气泡）。

湿转完成后，夹紧板放入湿转电转槽内，在转膜槽中加满电转液，插上电极（100V，1h），开始转膜。转膜槽置于有冰袋的泡沫箱中，保证电转一直处于低温下进行。转膜结束后，切断电源，取出杂交膜。

  

封闭与孵育

转膜之后迅速置于Tris-Buffered Saline(TBS)中，于回旋振荡器上室温下漂洗5min，以便移除残留的转移缓冲液。

随后将膜用TBST从上向下浸湿后，转移至含有封闭液（TBST做溶剂，配5%脱脂牛奶）的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h或4℃过夜封闭（PVDF膜在甲醇活化后是带电的，因而在转膜时会将蛋白吸附，所以封闭的目的就是要将PVDF膜上无蛋白的部分空隙用奶粉填满，以免孵抗体的时候一抗二抗与之结合，产生非特异条带或者是背景杂乱）。

一抗：加入合适稀释浓度的一抗（用TBST稀释），室温，脱色摇床孵育1h；TBST室温脱色摇床洗3次，每次10min（一抗只能结合能与其特异结合的蛋白，其他没有结合的就被洗下来了）

二抗：加入合适稀释度（用TBST稀释）的碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗，室温，脱色摇床孵育1h；TBST室温脱色摇床洗4次，每次5min（二抗只能结合能与已结合蛋白的一抗结合，其他没有结合的就被洗下来了）

 

显色

辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法：用微量移液器取等体积的ECL试剂中的A、B发光液放在EP管中恢复至室温，按比例稀释混合。用去离子水稍微漂洗PVDF膜，再用滤纸贴脚吸去膜上残余液体，将膜平放，反贴法覆于A、B混合液滴上，避光反应3分钟，可适当延长；舍弃ECL混合液置于暗盒中曝光显影，曝光时间控制在30s左右。取出胶片立即完全浸入显影液中 1～2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。

 

相信大家看到这里应该已经弄懂了WB实验操作的原理和步骤了，其实没有各位看官想象得那么简单，每一个步骤都需要谨慎小心方能得出最后满意的实验结果，那实验结果的分析又会出现什么波折呢？好了，今天口水已经说干，且听菌菌下回分享~

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