生物炭基肥减氮施用改善烟田土壤环境

化肥过量施用导致土壤环境恶化，严重影响作物生产，生物炭基肥施用是提高土壤氮素存储和作物利用效率、缓解温室效应的重要措施之一。高碳基肥是以生物炭为主体的新型有机肥料，由生物炭(添加量为20%)、植物油粕、天然矿物质肥、腐殖酸、微量元素等原料组成，有机养分和无机矿物质营养均衡，大中微量元素营养均衡，对土壤微生物代谢和多样性有着重要影响，生物炭与化肥配施可以补偿土壤有机氮矿化的减少，并有助于调控氮的储存和利用。

一、实验设计与方法

1.1 实验设计

实验设置5个处理分别为，NF (不施肥)、GCK：常规施肥纯氮量为 111 kg/hm2 、G3 (高碳基肥料 450 kg/hm2 +99.9 kg/hm2纯氮)(减氮10%)、G5 (高碳基肥料 750 kg/hm2 +88.8 kg/hm2纯氮) (减氮20%)、 G7 (高碳基肥料1050 kg/hm2 +77.7 kg/hm2纯氮)(减氮 30%)。采用过磷酸钙和硫酸钾调控磷钾含量。每个处理 3 次重复，小区随机排列，设保护行。常规施肥(N∶P2O5 ∶K2O=1∶0.95∶3.37)，高碳基肥在移栽前随基肥条施，其他田间管理措施按当地优质烟叶生产技术规范进行。其中高碳基肥含总碳27.09%、总氮1.74%、磷 (P2O5) 1.28%、钾 (K2O) 0.86%、含水率 26.36% 、pH 8.19。

1.2 土壤样品采集

分别于移栽 30、60 和 90 d 采集土壤样品。采用抖落取样法采集烟草根际土壤，采集时去除表层 0~5 cm土壤，并剔除石块和动植物残体后，采集烟草根系周围土壤，放入自封袋后用干冰将采集的样品放至-80 ℃保存。

1.3 样品测定

采用碱解扩散法测定土壤碱解氮含量；采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗显色分光光度法测定土壤速效磷含量；采用火焰光度法测定土壤速效钾含量；采用电位法测定土壤pH。土壤微生物16S rRNA测序由Illumina MiSeq 平台完成。采用DNA抽提试剂盒提取土壤样本的基因组DNA，通过高通量测序对土壤细菌16S rRNA 的V3和V4区进行测定。

1.4 数据分析

测序数据进行预处理之后，将相似性≥97%的序列归为一个操作分类单元(OTU)单元，并将所有代表序列与数据库进行比对注释。利用 QIIME1.8.0 软件对得到的序列进行α 多样性分析。土壤细菌群落结构分析采用主成分分析方法，利用 OriginPro 2021 软件进行冗余分析(RDA)。

二、实验结果与分析

2.1 高碳基肥减氮施用对土壤化学性质的影响

高碳基肥减氮施用对土壤化学性质的影响如下表所示。结果表明，高碳基肥减氮施用提高了土壤pH、碱解氮、速效磷和速效钾的含量，其中G7处理提升土壤肥力效果较好。

2.2 土壤细菌16S rRNA测序和α多样性指数分析

不同处理细菌α多样性指数如下表所示。移栽后 30 d，高碳基肥减氮施用处理(G3, G5 和 G7)与 GCK 的 OTUs 数量和细菌多样性指数(Chao1 和 Shannon)差异不显著，但均显著高于 NF 处理(P＜ 0.05)；移栽后60 d，不同处理间的 OTUs 数量和 Chao1指数无明显差异，但是G3处理的Shannon指数、物种数量和 PD Whole tree 指数显著高于其他处理 (P＜0.05)；移栽后90 d，G3、G7 和 GCK 的 OTUs数量和物种数量无明显差异，但均显著高于 G5和NF (P＜0.05)；G3和G7的Chao1指数无明显差异，但均显著高于GCK、G5和NF (P＜0.05)；G7、 GCK和NF的Shannon指数无明显差异，但均显著高于 G5 (P＜0.05)，低于 G7。G3、G7、GCK 和 NF 的 PD whole tree 指数无明显差异，但均显著高于 G5 (P＜0.05)。整体来看，随着烟草生长，微生物群落丰富度和多样性逐渐升高。移栽后 60 和 90 d， G3处理的Shannon指数比移栽后30 d提高了。说明不同高碳基肥减氮施用对土壤细菌丰富度和多样性可造成不同影响。

2.3 高碳基肥减氮施用对土壤细菌群落结构的影响

分别对移栽后 30、60 和 90 d 的土壤细菌群落 OTUs丰度进行分析。其中，移栽后90 d土壤细菌群落丰富度和多样性指数最高，其群落OTUs丰度分析如下图所示。结果发现，不同处理土壤样品中共有OTUs数量为2 223个，占OTUs总数的5.43%。

对移栽后90 d不同处理和不同取样时期土壤细菌主成分(PCA)进行分析，结果如下图所示。移栽后90 d不同处理主成分1 (PC1)和主成分2 (PC2)对土壤样品的贡献率分别为 61.04% 和 21.59%，二者累计贡献率为82.63% 。GCK位于第一象限，G7位于第二象限，NF 位于第三象限，G3 和 G5 位于第四象限。说明高碳基肥减氮施用各处理分别与 GCK 和 NF 处理的细菌群落结构存在差异。不同取样时期主成分1 (PC1)和主成分2 (PC2) 对土壤样品的贡献率分别为24.17%和19.76%，二者累计贡献率为43.93%。移栽后60和90 d的土壤样品相似相较高，移栽后30 d 与60、90 d的土壤样品差异较大。说明土壤细菌群落结构的变化主要发生在烟草移栽后30~60 d。

2.4 高碳基肥减氮施用对细菌群落组成的影响

物种注释结果发现，45个土壤样品中共获得36 个门水平和1 024个属水平的细菌类群，不同处理和不同时期的土壤细菌群落多样性存在差异。移栽后30和90 d，各处理在门水平表现出相同的变化趋势，非优势微生物群落丰度增加，优势微生物群落丰度降低。其中，细菌群落中top 10的优势门包括了变形菌门，放线菌门、酸杆菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门和厚壁菌门，top10 的细菌群落相对丰度之和占全部注释的 95.68%~99.52%。与 GCK 相比，移栽后 30 和 60 d，G7 处理变形菌门相对丰度提高。在各个时期， G3和G7处理酸杆菌门相对丰度相较与GCK均有降低，以移栽后30 d，G7 处理降低幅度最大。与 GCK 相比，高碳基肥处理各时期均能提高拟杆菌门相对丰度(移栽后 30 d，G5 处理除外)。

2.5 土壤细菌群落组成与理化因子之间的关联分析

采用RDA分析土壤细菌群落组成与理化因子之间的关联，结果如下图所示。土壤理化指标在主成分1 (PC1)和主成分2 (PC2)共解释细菌门水平变化的 86.64%，4 种土壤理化指标和变形菌门、拟杆菌门、芽单胞菌门、厚壁菌门均与PC1表现出相关关系，土壤理化性质对PC1的贡献程度依次为速效钾＞速效磷＞pH ＞碱解氮；速效钾、速效磷和放线菌门、酸杆菌门与 PC2 表现出正相关关系。土壤理化指标在主成分1 (PC1)和主成分2 (PC2)共解释细菌属水平变化的 94.73%，4 种土壤理化指标和鞘氨醇单胞菌属、产黄杆菌属、Chujai⁃ bacter、布氏杆菌属、慢生根瘤菌属、黄色杆菌均与 PC1 呈正相关关系，贡献程度依次为 pH＞速效钾＞速效磷＞碱解氮。pH、速效钾、速效磷和芽单胞菌属、Chujai⁃ bacter、布氏杆菌属、黄色杆菌属均位于 PC2负值区域，与PC2负相关。以上结果表明，土壤理化因子与细菌群落结构密切相关。

总之，通过对不同高碳基肥减氮施用处理下植烟区土壤化学成分测定以及土壤细菌多样性的高通量测序分析，发现高碳基肥减氮施用能提高土壤肥力，增加土壤细菌多样性和丰富度，改变细菌群落结构。在门水平上，高碳基肥减氮施用提高了变形菌门和拟杆菌门相对丰度，降低了酸杆菌门相对丰度。在属水平上，高碳基肥减氮施用增加了植物根际促生菌(鞘氨醇单胞菌属)、假节杆菌属和鞘脂菌属的相对丰度，降低了反硝化细菌(产黄杆菌属)的相对丰度。土壤 pH、碱解氮、速效磷和速效钾对丰都植烟土壤细菌群落组成影响较大。每公顷施用高碳基肥料 1 050 kg/hm2 +77.7 kg/hm2 纯氮(减氮30%)对土壤肥力改善效果最优，对土壤细菌多样性影响较大。