揭示铁死亡监测全新机制

铁死亡是一种铁依赖性磷脂过氧化作用驱动的细胞死亡过程，在多种病理状况中起着至关重要的作用，包括癌症、缺血性器官损伤和退行性疾病等[1]。目前研究发现的两种主要铁死亡监测机制：一种是由谷胱甘肽过氧化物酶4 (glutathione peroxidase 4, GPX4)介导的，通过将磷脂过氧化物(phospholipid peroxides, PLOOH)还原为相应的磷脂醇来抑制铁死亡；另一种是由FSP1、DHODH、NOS2和GCH1等酶介导的，这些酶会产生具有自由基捕获抗氧化(antioxidant, RTA)活性的代谢物，防止PL过氧化，抑制铁死亡[1-3]。肿瘤细胞铁死亡如何参与或抑制抗肿瘤免疫一直存在争议, 确定是否存在独立于GPX4和RTA的额外监视机制尤为重要，可为开发新型联合疗法提供新靶点。

作者使用GPX4抑制剂RSL3和胱氨酸饥饿诱导人纤维肉瘤HT1080细胞铁死亡，进行CPISPR激活筛选，发现7个基因与抵抗铁死亡相关的基因，包括5个已确定的铁死亡抑制因子：SLC7A11、NFE2L2/NRF2、FSP1、GCH1和NOS2，还有两个未被报道具有铁死亡调控功能的脂质修饰酶MBOAT2和PLA2G2F。为了验证MBOAT2和PLA2G2F是否具有抑制铁死亡的功能，作者通过在HT1080细胞中过表达MBOAT2和PLA2G2F，再给予铁死亡诱导剂处理。作者发现分别过表达MBOAT2和PLA2G2F均能显著抑制RSL3或者Erastin诱导的铁死亡。在敲除GPX4，或者同时敲除GPX4和FSP1的HT1080细胞中，过表达MBOAT2仍然能显著抑制人成纤维肉瘤细胞细胞铁死亡，表明MBOAT2是一种不依赖于GPX4和FSP1的强效铁死亡抑制基因。

图1. MBOAT2是一种不依赖于GPX4/FSP1的铁死亡抑制因子

作为膜结合O-酰基转移酶(Membrane-bound O-acyltransferases, MBOAT)家族的成员，MBOAT2具有溶血磷脂酰基转移酶（LPLAT）活性，偏好将单不饱和脂肪酸(MUFA)转移到磷脂酰乙醇胺(Lyso-PE)，也可能转移到溶血磷脂酰胆碱 (Lyso-PC) 和溶血磷脂酸(Lyso-PA)[5-6]。MBOAT家族的另一个成员MBOAT5通过将PUFA(多不饱和脂肪酸)转移到PL以提高 PL-PUFA的水平来促进铁死亡。作者推测MBOAT2是否催化MUFA到PL，竞争性降低PL-PUFA含量并最终导致铁死亡抗性细胞状态。MUFA的从头脂肪生成始于乙酰辅酶A羧化酶(ACC)形成丙二酰辅酶A。ACC抑制剂TOFA以剂量依赖性方式诱导MBOAT2过表达的HT1080-GPX4^KO细胞以及RSL3诱导过表达MBOAT2的HT1080细胞铁死亡，并且可以完全消除MBOAT2的铁死亡抑制活性，表明MBOAT2铁死亡抑制作用依赖于脂肪生成。从头合成的饱和脂肪酸(SFA)通过SCD1转化为MUFA，作者发现使用SCD1抑制剂CAY10566或者敲除SCD1消除了MBOAT2对RSL3或GPX4敲除诱导的铁死亡的保护活性。并且MBOAT2过表达后，外源MUFA的保护功能在HT1080-GPX4/SCD1^DKO细胞中进一步增加，而MBOAT2敲低显着减少了外源性MUFA的保护作用，以上数据表明MBOAT2的铁死亡抑制功能需要内源性或外源性MUFA。

图2. MBOAT2 的铁死亡抑制功能需要内源性或外源性MUFA

由于MBOAT2依赖MUFA抑制铁死亡，作者猜想MBOAT2是否通过PL重塑抑制铁死亡。作者使用HT1080和MBOAT2过表达的HT1080细胞进行非靶向脂质组学分析，发现MBOAT2过表达选择性增加含有单不饱和脂肪酸的磷脂酰乙醇胺(PE-MUFA)的生成，降低含有多不饱和脂肪酸的磷脂酰乙醇胺(PE-PUFA)的生成。作者推测存在竞争性PE重塑模型，MBOAT2 选择性地将MUFA-CoA转移到lyso-PE以竞争性减少PUFA-CoA掺入lyso-PE。组学数据进一步分析发现与对照相比，MBOAT2的过表达选择性地增加PE-MUFAs， PC-MUFA和其它PL-MUFA并未受到显着影响，而PE-PUFA 在MBOAT过表达后显着降低。PE-PUFA是磷脂过氧化的首选底物和铁死亡敏感性的主要决定因素，MUFA偏好lyso-PE酰基转移酶MBOAT2与 PUFA偏好的lyso-PE酰基转移酶在lyso-PE竞争，在具有主要 MBOAT2活性的特定细胞或组织中，PE重塑促使细胞转向高PE-MUFA水平但低PE-PUFA 水平的状态，导致铁死亡抗性。

图3. MBOAT2通过磷脂重塑抑制铁死亡

作者通过数据库比较MBOAT2 mRNA水平发现MBOAT2在前列腺癌(PCa)中特异性上调。MBOAT2 mRNA与人类PCa样本中的雄激素受体(AR) mRNA呈正相关，在AR⁺ PCa细胞系中高表达，在AR^- PCa细胞系中低表达，并且AR⁺ PCa细胞系比AR^- PCa细胞系更能抵抗铁死亡。通过ChIP-qPCR分析，作者进一步确认AR与MBOAT2 的顺式作用元件结合，并且AR激动剂二氢睾酮(DHT)可促进二者结合，AR拮抗剂ENZ抑制二者结合，并且DHT促进AR⁺ PC细胞系中MBOAT2表达，而ENZ降低MBOAT2 表达。作者随后也确认了MBOAT2是否调节AR⁺ PCa细胞的铁死亡敏感性。MBOAT2 敲除或敲低使前列腺癌细胞LnAR和LNCaP对RSL3诱导的铁死亡着更敏感。并且MBOAT2敲低通过显着增加PE-PUFA的含量但降低PE-MUFA 的含量来重塑PL。因此，AR信号通过上调MBOAT2表达并重塑细胞PL，抑制铁死亡。

图4. AR信号通过MBOAT2调节前列腺癌细胞的铁死亡敏感性

AR⁺ PCa细胞中MBOAT2高表达促进了铁死亡抗性，作者猜想拮抗AR作用是否会通过下调MBOAT2促使肿瘤细胞对铁死亡诱导敏感，从而成为一种潜在的治疗策略？作者发现ENZ (FDA批准的第二代针对AR靶向治疗剂)与ARV-110（一种临床阶段的AR降解剂）均以剂量依赖性方式显著抑制内源MBOAT2表达，并且使多种AR⁺ PCa细胞对RSL3 诱导的铁死亡敏感。多西环素(Dox)可诱导Cas9表达，作者使Dox处理LnAR-iCas9-gGPX4 (LnAR-igGPX4)细胞系诱导GPX4敲除，发现ENZ可进一步增强细胞中GPX4敲除引发的铁死亡。在LnAR-igGPX4移植瘤动物模型中，Dox或ENZ单独处理仅适度抑制肿瘤生长，而Dox与ENZ的组合可显著抑制肿瘤生长，表明ENZ与铁死亡诱导的联合治疗是治疗AR⁺PCa的一种潜在方案。

图5. AR拮抗剂使AR⁺前列腺癌细胞对铁死亡敏感

另外作者发现MBOAT家族中除了MBOAT2，MBOAT1也可以抑制GPX敲除或者RSL3诱导的铁死亡。与MBOAT2一样，MBOAT1通PL重塑抑制铁死亡，并偏向于PE-MUFA。有趣的是，与MBOAT2相反， MBOAT1在女性癌症中高表达，包括卵巢癌、乳腺癌和子宫内膜癌等。与MBOAT2功能发现类似，作者发现雌激素(ER)受体信号调控MBOAT1表达，MBOAT1表达下调会导致ER⁺乳腺癌细胞T47D和MCF7对铁死亡更敏感。ER抑制剂Fulvestrant与铁死亡诱导剂IKE单独使用不能抑制ER⁺乳腺癌细生长，相反Ful和IKE的组合显著抑制了肿瘤生长，提示靶向ER与铁死亡诱导的联合治疗可能是耐药性ER⁺乳腺癌的潜在治疗方法。

图6. ER拮抗剂Fulvestrant通过下调MBOAT1表达促进ER⁺乳腺癌细胞铁死亡敏感性

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究阐述了一种调控铁死亡监测的新分子机制，即MBOAT1/2介导的磷脂重塑抑制癌细胞铁死亡，并且MBOAT1和MBOAT2在ER⁺和AR⁺肿瘤中分别受到不同的性激素调节以抑制铁死亡，为癌症联合疗法提供了新见解。然而，减少PL过氧化底物是否是 MBOAT1/2介导的铁死亡抑制的唯一机制仍有待进一步实验确定，以及PL-MUFA抑制铁死亡的机制也有待进一步研究。目前的研究虽然为两种潜在的癌症联合疗法提供了见解，然而到目前为止尚未开发出用于临床的铁死亡诱导剂，从而限制了临床前阶段的研究。