单克隆抗体（mAb）是目前最主流的肿瘤免疫治疗方式，且占据了已获批生物药的绝大部分，但大多数单克隆抗体显示出细胞毒性活性不足。为了克服这一点，研究将细胞毒性小分子与高度特异性/选择性的mAb相结合，形成一类新的药物形式，即抗体偶联药物（ADC)。最近一段时间针对ADC的多项国内外重大交易案的达成，将其置于了行业的“聚光灯”之下，如：科伦向默沙东授权7款ADC药物，最高交易总额近95亿美元；辉瑞430亿美金收购Seagen；康诺亚/乐普11.88亿美元出售Claudin 18.2 ADC全球权益；映恩生物以16.7亿美元将2款ADC药物海外授权给BioNTech。
ADC由与细胞毒性小分子药物相连接的抗原特异性mAb组成。mAb分子的位点特异性可降低脱靶副作用，因其将偶联药物靶向递送至特定的目的细胞。因此，从原理上讲，ADC可提高强效细胞毒素的治疗指数，即毒性剂量与有效剂量的比值。亦即，ADC旨在将mAb的特异性与毒素的高效力结合起来。
近年来，ADC的开发工作已经转向独立开发ADC的每个成分，即抗体、连接子和细胞毒性药物“弹头”，并综合性地优化ADC的药理学特性并提高这些化合物的治疗指数。虽然ADC的概念在理论上很简单，但将各种成分组合成一种优化的功能性治疗药物仍是一个不小的挑战，比如偶联方法的选择。
ADC可以使用多种化学和酶偶联技术形成，这可能对偶联位点、药物-抗体比（DAR）和/或DAR异质性产生重大影响。通常，化学偶联方法利用可溶于溶剂的天然或工程氨基酸，通过控制化学反应，与连接子共价结合形成ADC。另一方面，酶偶联利用一定的翻译后修饰，形成更均匀的DAR。因此，应根据偶联位点的靶位点特异性和所需的DAR分布，针对性地选择偶联工艺。
赖氨酸和半胱氨酸是两种主要的天然氨基酸，已被广泛用作生产ADC的非特异性偶联位点。偶联的非特异性和大量表面可接近的赖氨酸残基导致DAR分布宽泛，这在药代动力学（PK）和毒性特性、生产工艺和分析控制策略方面提出了一些挑战。与赖氨酸残基相比，天然半胱氨酸可以更好地用于降低异质DAR。为此，选择性地还原链间二硫化物，以提供2-8个游离巯基作为偶联位点，以获得具有降低异质DAR的ADC。
DAR分布和偶联位点的异质性对ADC的有效性和安全性起着至关重要的作用。为了制备具有高度同质DAR的ADC，必须采用位点特异性偶联方法。这些方法包括：(1) 将半胱氨酸或非规范型氨基酸工程设计进mAb，以便与有效载荷进行选择性偶联反应；(2) 插入“标签”以促进酶催化偶联。
研究显示，将两个非天然半胱氨酸工程设计至mAb的重链中，可形成DAR为2的高度同质的ADC。另一种类似的方法是对链间二硫键中涉及的两个半胱氨酸残基中的一个进行工程改造，以使另一个半胱氨酸残基可用于位点特异性偶联。虽然这些方法成功地实现了对DAR分布和位点特异性的控制，但可能导致mAb内部或相邻mAb分子之间产生不必要的二硫键，继而分别导致结合能力的下降和聚体。为了减轻这些挑战，必须开发和优化特定的还原过程。
与天然高丰度的半胱氨酸残基类似，硒代半胱氨酸或乙酰苯丙氨酸等非天然氨基酸也可以被工程设计至mAb，通过特定于其的化学作用，实现位点特异性偶联。例如，硒代半胱氨酸在结构上与半胱氨酸相似，但含有硒原子而不是硫原子，而乙酰苯丙氨酸与苯丙氨酸相似，但含有酮基。此外，无细胞表达系统也被报道用于设计、筛选和生产含有非天然氨基酸偶联柄的ADC。
除了化学偶联外，某些酶也被用来催化天然抗体和基因工程抗体的偶联，或者结合独特的反应柄来实现与对应官能团的特定化学反应。一种酶偶联方法利用转谷氨酰胺酶催化含伯胺的连接子与特定谷氨酰胺的伯胺侧链偶联，形成DAR为2的ADC。用于这种偶联策略的其它酶包括糖转移酶和甲酰基甘氨酸生成酶。β-1,4-半乳糖基转移酶(GalT)和α-2,6-唾液酸转移酶也被用于在Fc区存在的天冬酰胺残基的N-聚糖端添加醛基，作为氨基功能化药物的偶联位点。
除了偶联方法，为给定ADC选择最佳DAR也至关重要，必须仔细考虑。由于实际进入肿瘤细胞的药物比例非常小，每克肿瘤 ＜0.01%注射剂量，因此似乎需要更高的DAR和/或更强效的“弹头”才能达到足够的ADC功效。然而，高DAR可能导致清除率增加以及不必要的免疫原性，强效毒素也可能导致脱靶毒性。DAR 2-4的ADC已被证明可在缓慢清除和高效之间提供良好的平衡。除了DAR，药物-连接子的疏水性也会影响清除率。因此，调节连接子-药物的疏水性有助于使用具有更高DAR的ADC，即使其具有理想的清除率特性，且如果与低效力毒素一起使用，则将具有更高的治疗指标。在这种情况下，使用两种具有互补治疗效果的不同毒素组成的偶联物也将是提高治疗指数的一种策略。
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