烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）是细胞周期中的核心代谢物，NAD⁺耗竭是存在于原核和真核生物中的免疫机制。近期，在一些细菌内发现短的原核Argonaute蛋白（Ago）可以与在同一操纵子中编码的含NADase结构域（TIR或SIR2）协作，通过识别靶标核酸来诱导NAD⁺耗竭继而抵抗移动遗传元件（如噬菌体和质粒）的入侵[1，2]。然而，这种NADase/Ago原核免疫系统的潜在分子机制仍然未知。

为了研究TIR-APAZ和Ago蛋白之间的相互作用模式，作者首先从Maribacter polysiphoniae（以下简称TIR / Ago复合物，也称为SPARTA）中共纯化二元复合物，并在存在guide RNA（gRNA）的情况下测定其冷冻电镜结构。通过体外NAD降解实验证明，apo TIR/Ago和RNP复合物中的TIR结构域在催化上无活性，但tDNA结合可以有效地激活NADase活性。为了阐明激活TIR/Ago复合物的分子基础，作者重建了tDNA结合的四元复合物，并以2.95 Å的分辨率测定了其冷冻电镜结构。TIR/Ago-gRNA-tDNA复合物显示出具有四个TIR/Ago异二聚体拷贝的“蝴蝶形”结构，与生化结果一致，当RNP识别结合tDNA后可以诱导TIR/Ago 的高阶寡聚化。四个TIR/Ago复合物通过TIR结构域的四聚化形成两个翅膀区（wing region）。两个Ago分子与APAZ结构域结合成对称的头对头二聚体，形成蝴蝶的翅膀。两个翅膀及其各自的TIR在结构上是相同的，虽然它们以不对称的方式组成。然而，同一翅膀中的两个TIR/Ago单元采用不同的构象，分别称为 A/A' 和 B/B' 单位（图1上）。

对于另一种来自Geobacter sulfurreducens物种中的NADase/Ago系统（SIR2/Ago），作者以3.0 Å的分辨率解析了SIR2/Ago-gRNA-tDNA四元复合物的冷冻电镜结构。与TIR/Ago系统类似，tDNA结合可以触发SIR2/Ago系统的NADase活性。但是SIR2/Ago复合物在gRNA-tDNA双链存在下不会组装成高阶低聚物，这与TIR/Ago复合物的高阶寡聚化相反。生化实验和结构比对证明，SIR2/Ago系统通过识别结合tDNA使复合物获得更开放的构象，继而使SIR2结构域游离于APAZ/Ago结构域并获得NADase活性（图1下）。

图1 上：TIR/Ago-gRNA-tDNA四元复合物的四聚状态  下：SIR2/Ago-gRNA-tDNA四元复合物

研究两种系统NADase活性的激活机制，作者首先通过比较复合物激活和未激活状态的结构变化，发现在靶ssDNA结合后，均有一段loop从gRNA–tDNA双链转移，被重新拉伸并折叠成β链，表明该环可以作为检测gRNA–tDNA双链形成的传感器。该回路被称为“传感器回路”。接下来，作者通过体外ɛ-NAD⁺降解实验和蛋白聚集实验确定了在不同长度下ssDNA存在情况下NADase被激活的情况，发现两种系统至少需要15nt长度的ssDNA才可以顺利激活，该长度与结构上传感器回路阻挡的空间位置相符。

图2 左：TIR/Ago复合物对不同长度ssDNA的体外ɛ-NAD⁺降解实验  中： TIR/Ago复合物在不同长度ssDNA存在下聚集情况的Native PAGE  右：SIR2/Ago复合物对不同长度ssDNA的体外ɛ-NAD⁺降解实验

对于tDNA的识别，两种系统都利用Ago蛋白PIWI结构域中的保守传感器回路来检测，从而启动TIR或SIR2结构域中NADase活性所需的构象变化。但是TIR结构域需要寡聚以形成TIR/Ago系统中的活性口袋，而SIR2结构域通过识别tDNA结合增加其灵活性来激活。

图3 TIR/Ago和SIR2/Ago系统的NADase激活机制示意图