创建新生鼠肺静脉狭窄模型

肺静脉狭窄（PVS）是先天性心脏病中最具挑战性的临床问题之一，可导致继发性肺动脉高压和右心室（RV）肥厚，患儿两年内死亡率高达60%[1]。PVS有两个重要的特点，使其治疗极具挑战性：(1)肺静脉广泛性内膜增生，从狭窄处一直延伸至上游小血管；(2)肺静脉狭窄外科手术后患儿仍面临较高的再复发率，需要多次手术干预[2，3]。目前PVS仅有大型动物模型，如小型猪。由于缺乏合适的小动物模型，PVS恶性进展或复发的机制尚不清楚，导致尚无有效的治疗方式和药物干预的靶点[4，5]。本研究建立了一种新生大鼠PVS模型，为理解PVS发病机制，寻找干预靶点以及开发潜在的治疗方法提供了研究平台。

为了模拟PVS，研究团队对出生24h内新生鼠进行肺静脉环缩手术。研究者首先通过低温麻醉新生鼠，造成心脏停搏和可逆性呼吸暂停，以防止在手术过程中过度失血。然后将将新生鼠转移到冰床上维持麻醉，以仰卧位固定于体式显微镜下。术中应用正中横向切口开胸，暴露右肺静脉（图1a），并用28G针头进行环缩（直径为0.35mm），术后关胸并恢复乳鼠体温（图1b, c）。通过该方法建模术后死亡率低于5%，但PVS组幼鼠体重显著低于假手术（sham）组（图1d）。

图1 光伏束带的手术过程

肺动脉高压（PAH）是PVS最常见的并发症，在心动超声图表现为PA加速时间减少，研究人员在幼鼠出生后21天（P21）检测了PA加速时间来评估PAH和PVS。结果显示，PVS组的加速度时间显著缩短。相应地，肺动脉血流脉冲图像变为像“刀背”一样的形状（图2a-c）。除了心超外，研究团队还应用micro-CT测量P21天大鼠环缩处肺静脉直径，结果显示PVS组右肺静脉起始处肺静脉直径显著低于sham组。以上结果提示肺静脉环缩术构建成功，术后肺静脉显著狭窄。

图2 PVS大鼠的CT及超声心动图检查。

图3 PVS大鼠的大体肺图像

为了继续评估幼鼠PVS后的组织学和病理生理学变化是否与人类PVS患儿一致，研究人员首先评估了肺大体的情况，结果显示，PVS组右上、中叶存在肺充血，而sham组无明显肺充血（图3绿色箭头）。接着，研究人员检测了PVS上游肺静脉的内膜增生情况，研究人员发现PVS模型组在P21时，平滑肌层的厚度明显增加，上游肺静脉内膜显著增厚，（图4a-e, 红线）。为了评估重塑肺静脉中的弹性纤维和胶原纤维的表达情况，研究者进行了EVG染色和Masson染色，结果显示PVS组肺静脉弹性纤维和胶原纤维的表达较sham组显著上升（图5a-e）。这些结果提示，PVS引起血管平滑肌层变厚，胶原纤维和弹性纤维表达增加。

图4 PVS大鼠上游PV增厚。

图5 PVS组肺静脉弹性纤维和胶原纤维的表达较sham组显著上升。

为了进一步表征上游肺静脉增厚的细胞类型，研究人员采用α-SMA和cTnT免疫荧光染色来区分平滑肌细胞和心肌细胞。结果显示，PVS组显示平滑肌层厚度增加，管腔变窄（白色箭头）。而WGA和cTnT染色显示，两组间心肌细胞大小和心肌层厚度无差异（图6a-e）。这些结果提示内膜增生是平滑肌层增厚，而不是心肌细胞层。

图6 上游PV的免疫荧光。

研究团队接着评估肺的组织学变化。结果显示，相较于sham组，PVS组的小血管中有明显淤血（图7a红色箭头）。这与大体肺样本检查结果一致（图3a和b，绿色箭头）。此外，PVS组的肺泡数量显著减少（图7a和b），提示PVS损害了出生后的肺泡发育。在PVS组中也发现了肺小血管壁厚的增加（图7c和d），肺小血管的α-SMA强度增加（图7e和f）。这些结果均表明，PVS引起了广泛的肺小血管重构，这可能是PAH的原因。

图7 PVS大鼠的肺重构。

最后，研究者评估了右心室的组织学变化。结果显示，PVS组右心室游离壁厚度较sham组明显增加，右心室心肌细胞的大小也显著增加（图8a-d）。这进一步表明了PVS引起了PAH进而导致右心室重构。然而，PVS组右心室胶原蛋白含量与sham组相比并无显著差异（图8e, f），这可能是因为新生儿心脏具有较强的代偿能力，压力负荷情况下很少引起纤维化。

图8 PVS大鼠右心室重构

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究成功建立并评估了新生鼠PVS模型。与临床PVS患儿类似，PVS鼠也显示出广泛的肺静脉内膜增厚和继发性PAH。该模型将促进研究人员对PVS进展和复发的理解，并改善其治疗。与以往常用的PVS仔猪模型相比，大鼠模型有几个优点： (1)建立一只新生大鼠PVS模型不超过10 min，饲养大鼠的空间较小，繁殖时间较短，因此时间和经济要求较低；(2)只需要一个熟练的外科医生或学生即可完成建模，而仔猪PVS模型需要一整个外科团队；(3)啮齿动物更容易进行基因层面检测和药物评估。

该研究也存在一些局限性。首先，水平开胸术造成较大创伤，并且还会损害辅助呼吸的肌肉。未来应该研究更为微创手术方法。其次，尚缺乏对该模型进行长期评估。另外，环缩直径的大小是否影响PVS的进展也尚未确定。

未来，研究者将尝试构建PVS新生小鼠模型，并结合谱系追踪实验，以帮助确定PVS内膜增生的肌成纤维细胞来源，将进一步推进研究人员对PVS的理解。