维持线粒体内稳态是治疗多种疾病的有效策略，包括神经退行性疾病、心血管疾病、代谢紊乱和癌症等。通过自噬途径对线粒体进行选择性降解（线粒体自噬）是一种从酵母到人类都存在的保守的线粒体质量控制机制。探索线粒体自噬的小分子调控剂是极具价值的工作，既可以利用其解析复杂的生物学过程，又可为药物开发提供潜在候选小分子。在过去几年中，药物调节线粒体自噬在多种衰老相关疾病模型中显示出一定的治疗作用。然而，随着线粒体自噬调控剂研究数量的快速增长，可以频繁观察到实验方法学的缺憾与不足，这种情况导致一些研究会得出不可靠或误导性的结论。因此，从方法学完整性角度分析线粒体自噬药理学研究，以及提供一个实用、可靠的方法学指南是具有重要的科学意义。
作者首先系统总结了线粒体自噬的分子机制，并且基于线粒体自噬调控药物开发的难点提出了线粒体自噬调控剂表征系统 (Mitophagy Modulator Characterization System, MMCS) ，并为药物干预线粒体自噬提供了重要的靶点总结。此外，作者从方法学角度对近20年来发表的线粒体自噬调控剂的药理学研究文章进行了系统分析。综上，本文提供了线粒体自噬调控剂的研究概况，旨在通过引入高质量表征标准促进安全、有效的线粒体自噬调控剂的开发。
线粒体是一种存在于大多数真核细胞中的细胞器，具有双层膜结构，其主要功能是参与细胞代谢和产生化学能，并且作为各种细胞信号通路的“中心”，能够决定细胞的生死。线粒体是一个动态变化的细胞器，其形态和数量会随着生理过程和病理刺激而大幅度变化。此外，线粒体还会参与钙流稳态、类固醇合成、细胞周期、神经炎症和各种类型的细胞死亡。然而，线粒体特别容易受到损伤，其功能障碍被认为是衰老相关疾病的关键病理因素，包括神经退行性疾病、糖尿病和癌症。线粒体自噬是一种选择性的巨自噬，通过自噬体-溶酶体途径选择性地将受损的线粒体靶向降解。线粒体自噬的重要性体现在其与衰老中两个标志性特征密切相关，即线粒体功能障碍和自噬功能受损。因此，对于线粒体自噬机制的探索以及在衰老疾病中通过药理学恢复正常水平具有重要的医学意义（图1）。
图1 线粒体自噬的药理学调控是治疗衰老相关疾病的重要策略
(图源: Dong, Yu, et al. Pharmacological Research, 2023)
近年来，小分子化合物在促进线粒体自噬治疗衰老相关疾病方面受到广泛的关注和认可，我们可以看到相关药理学研究的数量逐年增加（图2）。此外，一些线粒体自噬诱导剂已经确定了分子机制和药物靶点，并在阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病模型中显示出优秀的保护作用。深入探索药理调节线粒体自噬的特异性靶点会为合理设计和高内涵筛选线粒体自噬控剂提供重要的参考，最终服务于临床应用。然而随着线粒体自噬调控剂的研究迅速增加，常常会观察到一些研究未能提供充足的证据确认(a)线粒体自噬诱导或抑制的作用，(b)选择性线粒体自噬和一般巨自噬之间的区分，(c)线粒体自噬调节和其药理活性之间的因果关系。由于线粒体自噬是一个复杂而动态的过程，单一的实验通常不足以确定线粒体自噬的状态。在众多可用的线粒体自噬监测方法中，尤其是对于刚刚进入该领域的研究者来说，选择适当的实验方法来鉴别选择性线粒体自噬调节剂并不是一件容易的工作。实际工作中缺乏一个实用、可靠的方法学指南来表征选择性线粒体自噬调控剂。
图2 近20年来线粒体自噬药理学研究的数量逐年增加
(图源: Dong, Yu, et al. Pharmacological Research, 2023)
路嘉宏教授团队提出了线粒体自噬调控剂表征系统（Mitophagy Modulator Characterization System, MMCS）（表1），这个指南可以对线粒体自噬药理学研究中的方法学完整性进行系统评价，同时也可以在课题设计过程中实验方法的选择上提供实用性的参考。MMCS包括11个类别，分为两部分：A)线粒体自噬表征分析；B)功能和药理特性分析。第一部分涵盖了6个实验类别：1.线粒体自噬小体或线粒体自噬溶酶体的可视化；2.线粒体的定量，包括检测线粒体数量、驻留蛋白含量和mtDNA数量；3.线粒体自噬关键蛋白的分布和含量；4.线粒体自噬潮；5.自噬核心机制相关指标；6.评估其他选择性自噬调控情况。第二部分涵盖了5个实验类别：7.线粒体结构和功能；8.确定线粒体自噬调节和药理作用之间的因果关系；9.鉴定线粒体自噬调节的分子机制和具体靶点；10-11.在多种细胞系和动物模型中检测线粒体自噬调节作用。
表1 线粒体自噬调控剂表征系统 (Mitophagy Modulator Characterization System)
(表源: Dong, Yu, et al. Pharmacological Research, 2023)
传统的线粒体自噬诱导方法包括使用CCCP造成线粒体膜电位迅速下降或使用Antimycin A/oligomycin破坏线粒体呼吸链。然而，这些有毒的线粒体自噬诱导剂是会破坏线粒体稳态并致使整个细胞产生应激情况。在这种情况下，使用这些经典的线粒体自噬诱导剂来分析线粒体自噬的生理过程或探索与衰老相关疾病的治疗靶点是存在潜在的问题。近年来，具有保护作用的线粒体自噬诱导剂陆续被报道，其中一些药物明确了分子机制和药物靶点，这包括NAD, SIRTs, USP30, p53, Nrf2, PINK1, MCL-1, 和ROCK（图3）。通过总结和分析这些特异性靶点会为高内涵筛选与合理设计线粒体自噬控剂提供重要的参考。
图3 线粒体自噬调控剂药物开发中的重要靶点
(图源: Dong, Yu, et al. Pharmacological Research, 2023)
健康和动态的线粒体池对于维持细胞存活至关重要，然而由于年老和外源性不良因素导致线粒体损伤会造成ROS生成、钙泄漏、炎症、基因组不稳定和各种类型细胞死亡，进一步发生发展为衰老相关疾病。因此，及时和特异性地通过线粒体自噬清除受损的线粒体对于维持健康至关重要。在实验室模型系统和人体样本中的数据表明，缺陷的线粒体自噬与多种衰老相关疾病密切相关。在过去的十年中，越来越多的研究确认了线粒体自噬调控剂在各种疾病模型上的疗效。综上，本文从方法学角度对近20年来的线粒体自噬调控剂药理学研究进行系统评价，并且基于线粒体自噬调控药物开发的难点提出了线粒体自噬调控剂表征系统，并对重要的药理调控靶点进行总结，旨在通过引入高质量表征标准促进安全、有效的线粒体自噬调控剂的药物开发用于治疗衰老相关疾病。
