揭示Dna2移除减数分裂细胞中ssDNA-RPA纤丝的分子机制

ssDNA (single-strand DNA)是DNA复制和修复过程中形成的中间结构，通常在DNA复制时后随链冈崎片段合成和同源重组修复DNA双链断裂时形成。ssDNA与单链DNA结合蛋白RPA形成的ssDNA-RPA纤丝是激活DNA损伤修复检验点的重要信号，及时去除ssDNA-RPA纤丝结构是维持基因组稳定的关键环节。减数分裂过程中会产生大量的程序性DNA双链断裂，使得细胞内产生ssDNA-RPA纤丝结构的概率显著增加。但目前关于如何移除减数分裂细胞中ssDNA-RPA纤丝结构的机制还不清楚。

该论文以酿酒酵母为研究材料，构建了减数分裂特异删除Dna2的突变体, dna2-md (dna2-meiosis delete)，发现dna2-md产生的孢子不能存活，染色体错误分离率显著升高，表明Dna2缺失会导致减数分裂存在严重缺陷。进一步，通过控制诱导Dna2降解和表达的时间，作者锚定了Dna2主要在第一次减数分裂的粗线期发挥作用（图1）。接下来，作者系统探究了Dna2缺失导致减数分裂严重缺陷的分子机制。首先，通过染色体铺片和免疫荧光实验发现dna2-md中会累积大量的RPA; 进一步，ChIP-seq实验显示dna2-md中累积的RPA会随着减数分裂进行沿DNA双链断裂位点两侧分布（图2）；有意思的是，DNA单向/双向电泳-Southern杂交实验显示累积的RPA并没有影响dna2-md中DNA双链断裂的产生，断裂末端的切割，重组中间体的形成以及重组产物crossover和non-crossover的含量（图3），但脉冲场凝胶电泳-Southern杂交实验却表明dna2-md中的DNA双链断裂修复存在明显缺陷（图4）。针对上述矛盾点，作者推测dna2-md中累积的RPA可能是在重组偶联的DNA合成过程中， DNA聚合酶δ的链取代活性催化产生ssDNA，进而被RPA覆盖后产生ssDNA-RPA纤丝。当Dna2缺失后，ssDNA-RPA纤丝无法有效被移除，使得DNA双链断裂修复最后的缺口不能被链接，导致基因组不稳定，最后产生的孢子不能存活。据此，作者用羟基脲抑制重组偶联的DNA合成后，dna2-md中果然不再累积大量的RPA。基于上述研究结果，作者提出了Dna2移除减数分裂细胞中ssDNA-RPA纤丝结构的作用模型（图5）。

图1 Dna2在第一次减数分裂的粗线期发挥重要作用。

图2 dna2-md中大量累积的RPA在DNA双链断裂两侧富集。

图3 dna2-md中累积的RPA对减数分裂重组的影响。

图4 dna2-md中DNA双链端裂的修复存在明显缺陷。

图5 Dna2在减数分裂中移除ssDNA-RPA纤丝的模式图。

文章结论与讨论，启发与展望

本论文拓展了人们对DNA双链断裂修复的认识，同时，对Dna2的生物学功能有了更加全面的理解，虽然Dna2在有丝分裂和减数分裂DNA双链断裂修复中都发挥作用，在有丝分裂主要参与DNA双链断裂末端的切割，这与减数分裂中的作用环节明显不同。目前，本论文暂未直接观察到ssDNA-RPA纤丝结构，这也是作者目前着力解决的问题。