辛苦取样后，将样品冷冻至-80℃，然后放入液氮存储系统是许多实验室的常见工作流程。但是，预冷的-80℃样本可能需要数小时才能达到系统冷冻温度（约-190℃）。如果样本在降温至-190℃前，无关样本升温，则其温度有可能超过玻璃化转变温度（Tg）。
所以，为了让所有的样本保持在Tg（-135℃）以下，实验人员必须了解并遵守正确的工作流程。确保样本在随后的常规存储/取出操作中，有足够的时间在暴露于室温之前到达到深低温。
在本文中，我们将展示将-80℃样本放入-190℃自动化液氮存储系统的冷却速率实验结果，常规冻存架抽取期间无关样本的升温速率，以及每次冻存架抽取造成的热量损失。最后，针对将预冷却-80℃生物样本放入气相液氮罐，提供最佳实践。
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前言
由于细胞的复杂性和脆弱性，它们通常在受控的降温过程中进行冷冻。一般情况下，生殖细胞会被玻璃化冷冻，但体细胞的冷冻速率会控制在-1℃/min，直至冷冻至-80℃。这种可控速率的冷冻过程可以在程序降温仪中完成，如Thermo Scientific 的CryoMed™，也可以在被动设备中完成，如Azenta的细胞程序性降温盒或 Thermo Scientific的Mr.Frosty™。在受控速率冷冻过程之后，会将细胞（冻存管中）转移到更高密度的冻存盒中，并移入-80℃冷冻冰箱或-190℃自动化液氮存储系统中。
在初始冷冻环境之外的任何地点，转移生物样本都会导致它们温度升高。升温的程度取决于它们的初始温度、瞬时环境温度和暴露时间。如果移入LN2液氮罐中，目的是将样本保持在-135℃（水的玻璃化转变温度Tg）以下，则必须为所插入的样本保留足够的时间平衡到液氮温度，否则在常规瞬态无关样本暴露期间有超过Tg的风险。
本次介绍关注的是从-80℃环境到周围环境再到-190℃自动化液氮存储系统的瞬时升温，以及-190℃自动化液氮存储系统达到深低温的时间。它还将比较将单个冻存管运输并放入空冻存盒与将单个冻存管放入周围填充有冻存管的冻存盒（冻存盒位于-190℃自动化液氮存储系统中）的情况。此外，它还将比较环境与LN2温度的冻存盒在样品升温方面的情况。
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材料
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装有4.5kg干冰的常规冷却容器
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Chart MVE 1500系列气相液氮罐（-190℃）
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Azenta 2mL冻存管和标准10x10 冻存盒（ 所有冻存管装有1mL H2O）
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Azenta Cryo Tube Gripper，冻存管夹管器
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36 AWG T型热电偶，安装在水位中间，接触冻存管内壁
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测量计算TC-Temp数据采集单元使用TracerDAQ 软件（以0.5hz采样）
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方法
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2mL冻存管，装有1mL水，安装细丝热电偶
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冻存管在干冰中冷却和平衡
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机械臂装置从LN2液氮罐中取出冻存架，并推出冻存盒
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取下冻存盒盖，从干冰中取出冻存管，放入冻存盒
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替换盖子，将冻存盒放回冻存架上
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冻存架自动降回到-190℃ LN2液氮罐中
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结果
冻存管升温是由于冻存管暴露在环境空气中，加上冻存架和冻存盒暴露在环境空气中引起的。已有实验表明，将冻存架暴露在LN2液氮罐外部，会显著影响冻存管的升温，导致冻存管放回到液氮罐中时，管升温加速。因此，冻存管、冻存架和冻存盒暴露在周围环境中的总时间将对冻存管的总升温产生直接影响。这些实验测量涵盖了每个组成部分暴露于周围环境的总时间以及对冻存管温度的总体影响。
将两个冻存管装入1mL水，将细丝热电偶引线放入其中，在干冰中冷冻，使其温度平衡至约-77℃。将10 x10的冻存盒放置于LN2液氮罐中平衡24小时，冻存盒其中一个角落有8个冻存管，形成隔热的方形屏障，其它位置空置（见图1）。这种配置变量为冻存盒存储密度，放置在隔热正方形中的冻存管代表放置在完全填充冻存盒中的冻存管，而单独放置的冻存管代表放置在周围没有冻存管的稀疏填充冻存盒中的冻存管（即空盒）。
图1
机械臂装置直接提起冻存架，推出10 x 10冻存盒。机械臂的使用消除了影响冻存架搬运的人为因素。待冻存架和冻存盒暴露五秒钟后，将两个冻存管从干冰中取出，用热电偶丝固定，以最大限度地减少触摸引起的升温。取下冻存盒盖子，在35秒时插入两个冻存管，并更换盖子。将1号冻存管放在周围（先前冷冻的）冻存管的中心位置，将2号冻存管单独放在8×8（靠近角落）的位置。将冻存盒放回冻存架，通过机械臂装置立即将冻存架放回液氮罐。冻存架和冻存盒的整个暴露时间为55秒。冻存管在环境空气中的时间是30秒，在回到-190℃的环境之前，在冻存盒中的时间是25秒。
图2
图2 显示了从干冰到-190℃ LN2液氮罐的转移过程中，两个冻存管的温度变化。冻存管1（被包围）升温了13℃，而冻存管2（单独）升温了15℃。在放入冻存盒的几秒钟内，两个冻存管都开始冷却（在进入冻存盒之前大约20秒钟）。这一点很重要，其表明在进入LN2 液氮罐之前将冻存管放入冻存盒可以停止升温，因为冻存盒明显比冻存管冷。同样值得注意的是两个冻存管的冷却速度。单独放置的冻存管（冻存管2）冷却得更快，很快就变得比被包围的冻存管（冻存管1）更冷。这是因为冻存管1周围的无关冻存管在冻存架暴露期间和之后温度显著升高（橙色线，“周围无关的冻存管”）。单独放置的冻存管（冻存管2）立即暴露在-190℃的环境中，而被包围的冻存管（冻存管1）由于周围无关冻存管的热量而暴露在更温暖的环境中。
第一次暴露后，冻存管1和冻存管2达到-180℃的时间分别为15.8秒和18.4秒。假设标准的冻存架取出将无关样本升温约40℃，则从LN2液氮罐中取出冻存架（放置-80℃冻存管）的时间不得超过20分钟。
将-80℃冻存管放入LN2液氮罐的过程中，影响冻存管升温的另一个变量是冻存管所放入的冻存盒的温度。因此，为了探索这一点，我们进行了一项实验，比较将-80℃冻存管放入环境温度与-190℃冻存盒的效果。在液氮罐外部使用LN2蒸汽预冷-190℃的冻存盒。
图3
在另外的实验中，从干冰中取出冻存管，放入冻存盒，插入冻存架，然后放入-190°C LN2 液氮罐中。冻存管暴露在环境空气中约20秒，冻存架暴露约35秒（比图2实验的暴露时间短）。环境盒子中的冻存管增加了17℃，而LN2冻存盒中的冻存管增加了8℃。
由于时间和冻存盒条件与之前图2实验的不同，因此无法直接比较准确的冻存管温度和变化率。然而，我们可以了解到，冻存盒的温度对冻存管升温的时间和程度有显著影响。
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最佳实践
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尽可能缩短-80℃样本暴露于周围环境的时间；
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尽可能缩短冻存架离开LN2液氮罐的时间，这对无关样本（周围的冻存管）的温度升高至关重要；
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将冻存管转移到已经达到最终LN2温度环境的冻存盒（容器）中完全填充冻存盒与稀疏填充冻存盒会影响冻存管的冷却速度，必要时需保持一致；
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对于放置在LN2液氮罐中的-80℃冻存管，至少20分钟内，不得再次从液氮罐中取出（减少无关样本暴露机会）。
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结论
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通常情况下，需要通过过冷、核化和冷却速率来精确控制细胞的冻存。然而，我们没有监控和控制-80℃生物样本向最终储存的转移。这些实验显示了瞬时暴露期间的升温程度、随后的冷却以及影响它们的变量。
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生物样本从-80℃转移到LN2液氮罐过程中，需要遵从标准工作流程或至少确保一致性。
注：Original material presented at ESBB 2015 by John Fink, Matthew Albert and Matteo Salvetti. Azenta Life Sciences. Chelmsford, MA. USA.
