揭示病原菌抑制宿主液-液相分离帮助病原体逃避宿主防御的新机制

内质网应激是细菌感染的一个共同特征。未折叠蛋白反应（UPR^ER）可恢复内质网稳态，在宿主对病原体的防御中发挥重要作用。内质网可为细胞内病原菌提供复制的环境，促进细菌的感染。然而，UPR^ER的激活也触发先天免疫反应，导致识别病原体并进行适当的防御。有证据表明细菌病原体采用多种机制在感染期间调节宿主UPR^ER。例如，布鲁氏菌和衣原体诱导UPR^ER，为病原体提供复制空泡，并促进其生存。嗜肺军团菌、猪肺炎支原体和结核分枝杆菌抑制宿主UPR^ER作用的机制最近也被报道。探索病原体调控宿主UPR^ER的功能及机制将为干预治疗提供潜在的靶点。然而，病原体如何操纵宿主UPR^ER介导免疫逃避在很大程度上是未知的。

病原体通过与宿主蛋白的效应相互作用来调节宿主的生理过程，以实现感染和致病。先前,课题组的研究使用遗传编码的光交联剂发掘了NleE和PSMD10之间的相互作用，并阐明其通过结合PSMD10的N端抑制其二聚化作用调节宿主细胞自噬。本研究中作者们在邻近蛋白交联技术（PEPC）的帮助下，鉴定了宿主C4型锌指蛋白ZPR1是效应因子NleE修饰的新型底物。他们发现了ZPR1可以通过LLPS组装，并且其与k63-泛素的结合能力促进ZPR1的体外相分离过程。ZPR1在转录水平调控CHOP介导的UPR^ER通路。有意思的是，作者们发现NleE通过破坏ZPR1与k63-泛素链的结合来干扰ZPR1的LLPS从而调控转录，拮抗宿主UPR^ER通路。进一步研究证实了NleE-ZPR-1介导的UPR^ER调控在EPEC病原菌感染时亦发挥作用。总的而言，该研究揭示了EPEC病原菌以NleE-ZPR1级联依赖的方式在转录水平上限制宿主的UPR^ER，帮助病原体逃避宿主防御的机制。

为了鉴定活体细胞内效应因子NleE的底物，该研究使用了基于遗传编码BetY非天然氨基酸的邻近蛋白交联（PEPC）技术（图1A）。BetY选择性地与近距离Cys残基发生反应形成稳定共价键(图1B)，有助于捕获瞬时/弱的共价复合物（图1C）。串联变性纯化联合质谱分析及系列实验证实了（图1D-F）宿主内ZPR1是效应因子NleE的相互作用蛋白。

图 1 活细胞中 NleE 与宿主 ZPR1 相互作用

作者们基于免疫荧光染色ZPR1形成液滴(图2A)及无序结构域预测网站预测ZPR1可能包含多个无序区域，推测人源ZPR1可能发生液-液相分离。在体外相变实验中，他们发现纯化的ZPR1蛋白发生LLPS（图2B-C），形成的液滴对1,6-己二醇处理敏感(图2D)。这些结果证实ZPR1在体外经历了液-液相分离。

随后作者们发现ZPR1具有受NleE抑制的结合K63-泛素链的能力(图2E-F)。K63-泛素链促进ZPR1相变的发生(图2G)，而被NleE修饰的ZPR1位点突变则显著损害ZPR1 LLPS，并抑制野生型ZPR1蛋白的相变(图2H)。由此作者认为NleE参与调控ZPR1 LLPS过程。

图 2 NleE 抑制 k63-ub 促进的 ZPR1 LLPS

进一步研究证实细胞中的ZPR1液滴可能参与转录调控（图3A-B），且与RNA聚合酶II斑点、转录介质复合体成分MED1斑点（图3C-D）及组蛋白H3.3接近(图3E-F)。此外，ZPR1的LLPS受到低浓度转录产物RNA的诱导和高水平RNA的抑制（图3G-H）。这些结果表明ZPR1液滴与转录中介复合物（TMC）相关。重要的是EPEC感染时细胞内ZPR1液滴受到依赖于NleE 的调控（图4），表明NleE调控活细胞中ZPR1液滴的形成。

图 3 ZPR1 液滴与转录中介复合物相关

图 4 EPEC 感染依赖于 NleE 调控 ZPR1

基于RNA测序的分析结果发现NleE高度特异的影响宿主细胞CHOP-UPR^ER通路的转录(图5A-B)及表达(图5C)。CHOP的mRNA片段具有与ZPR1结合的能力且具有诱导其相变的能力（图5D）。此外，染色质免疫沉淀后的定量PCR (ChIP-qPCR)实验证实，ZPR1在CHOP-UPR^ER通路基因启动子上显著富集（图5E)。免疫印迹结果亦显示ZPR1敲低细胞中CHOP表达水平下降(图5C)。这些结果共同表明ZPR1通过转录调控chop介导的UPR^ER通路。

图 5 EPEC 感染依赖于 NleE 调控 ZPR1

最后，在三敲除NleE其他底物的（3KO）细胞中，仍观察到EPEC感染影响CHOP和CHAC1转录(图5F)、抑制ZPR1液滴形成(图5G-H)。而且ZPR1缺陷并不能进一步影响NleE抑制的CHOP转录(图5I)。

文章结论与讨论，启发与展望

总之，该研究揭示了EPEC通过调节ZPR1相变干扰CHOP-UPR^ER的机制，为理解病原体如何调节免疫反应提供了新的视角。此外，多数效应因子和宿主目标之间的相互作用通常是弱的、短暂的，这使得它们很难在活细胞中被识别。该研究使用的PEPC其优势在于能够以高特异性和高效率在生理条件下富集微弱和短暂相互作用。这项研究拓展了PEPC方法的巨大潜力，将鼓励研究人员使用类似的策略研究蛋白相互作用。