免疫原性细胞死亡（Immunogenic cell death，ICD）是一种特殊的细胞死亡形式，与免疫系统的相应反应密切相关。[1]当肿瘤细胞或感染细胞发生细胞死亡时，它们可以释放出一系列信号分子和损伤相关分子模式（Damage-Associated Molecular Patterns，DAMPs），如热休克蛋白、ATP和核酸等。这些分子能够作为免疫刺激物，激活和招募免疫细胞，特别是树突状细胞和巨噬细胞。通过摄取和处理这些释放的细胞内容物，树突状细胞可以呈递肿瘤特异性抗原，并激活T细胞和其他免疫细胞，从而引发针对肿瘤细胞的免疫反应。[2]ICD具有重要的生物学意义，因为它可以增强肿瘤免疫治疗的效果。一些治疗手段，如放疗、化疗和免疫治疗，已被证明能够诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡。这种死亡形式的发生可以增加免疫系统对肿瘤的识别和攻击，从而提高治疗的成功率。[3]ICD在癌症治疗中的关键作用已日益受到关注。[4]通过研究胶质瘤（Glioblastoma，GBM）中ICD的机制，可以为发展新的治疗策略提供理论依据。特别是，诱导GBM细胞发生免疫原性细胞死亡可能有助于激活免疫系统，增强针对肿瘤的免疫应答，并提高治疗效果。但ICD在GBM中的重要作用还被深入研究。在此背景下，研究者基于与ICD相关的基因构建了一个与ICD相关的GBM分层模型，评估了不同分层患者的肿瘤微环境，并构建了一个预后评分模型。

 

该研究基于与ICD相关的基因构建了一个与ICD相关的GBM分层模型，评估了不同分层患者的肿瘤微环境，并筛选出与ICD相关的标记用于构建预后评分模型，然后评估了该模型的准确性和应用价值。进一步评估了风险评分与免疫细胞浸润、免疫功能、肿瘤突变负荷、肿瘤干细胞评分、药物敏感性和肿瘤免疫治疗反应之间的相关性。这有助于为未来的GBM研究和临床管理提供新的思路。

 

 

1.无监督聚类识别出两个与ICD相关的簇

研究者从训练集中提取了一个包含34个ICD相关基因的矩阵。通过在STRING数据库中构建蛋白质相互作用网络，我们确定了32个ICD差异表达基因(ICD-DEGs)，以进一步阐明它们之间的关联关系。（图1A）热图显示，在胶质瘤中，大多数ICD基因的表达水平显著上调，除了IFNA1、CD8A和HMGB1在正常样本中显著上调外，FOXP3和HSP90AA1的表达水平在正常和癌症样本之间没有显著差异。（图1B）有趣的是，我们发现大多数ICD相关基因在C2簇中表达水平较高（图1C-E），暗示了ICD高簇。相反，C1簇的表达水平较低，暗示了ICD低簇（图1F）。此外，生存分析表明ICD低簇的患者具有更好的生存结果（log-rank检验 P=0.0015）（图1G）。

 

图1 ICD表达模式的构建

 

 

2.功能富集和两个ICD簇中的肿瘤微环境

为了进一步了解两个簇之间的生物学差异，研究者获得了两个簇之间的65个差异表达基因(DEGs)（FDR < 0.05和|fold change| > 2）。与ICD低簇相比，ICD高簇有6个下调基因和59个上调基因（图2A）。在GO分析中，这65个DEGs主要富集在与免疫相关的生物过程中，包括补体激活经典途径、体液免疫应答、免疫球蛋白产生、补体激活、免疫球蛋白复合物、T细胞受体复合物、抗原结合和免疫球蛋白受体结合。（图2B）同时，这65个DEGs主要涉及的KEGG通路富集分析包括T细胞受体信号通路、补体和凝血级联反应以及病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用。（图2C）此外，研究者进行了基因集富集分析，以确定两个簇激活的信号通路的差异。结果显示，细胞粘附分子CAM、趋化因子信号通路、细胞因子受体相互作用和细胞受体信号通路在ICD高簇中被激活，而ICD低簇中没有激活的免疫相关通路。（图2D）还评估了两个簇中的肿瘤微环境景观。ICD高簇具有更高的免疫得分，与免疫组分相关，并且具有较低的肿瘤纯度。（图2E）研究者注意到不同簇中的肿瘤浸润免疫细胞的比例有所不同。ICD高簇中抗肿瘤免疫细胞（如T细胞CD8和活化的T细胞CD4记忆细胞）的比例较高，而ICD低簇中激活的肥大细胞较多。（图3A，B）免疫细胞之间表现出一定相关性。（图3C）此外，几乎所有的HLA基因和免疫检查点（包括PD-1、PD-L1和CTLA4）在ICD高簇中的表达更高。（图3D，E）

 

图2 每个ICD相关群集的生物学特征

 

图3 不同ICD相关簇中肿瘤微环境免疫细胞浸润和转录组特征

3. ICD相关风险标识的开发与验证

基于65个差异表达基因(DEGs)，进行单变量COX回归分析以确定与光束状瘤多形性脑胶质瘤(GBM)患者的总生存(OS)相关的ICD相关DEGs。其中有6个与ICD相关的DEGs被认为是预后相关基因(图4A)。最终，在LASSO回归分析中识别出了4个与ICD相关的DEGs。随后，研究者使用这四个DEG构建了预测模型(图4B)。风险评分模型的算法公式如下：Risk score = (0.6422)*FOXP3 + (4.5648)*IFNA1 + (0.1994)*IFNG + (0.8709)*MYD88。对训练集和验证集中的每位患者计算了风险评分。根据训练集中患者评分的中位数，将患者分为高风险组和低风险组。生存曲线显示低风险组的生存时间显著更长(在训练集中log-rank检验P < 0.001；在测试集中P = 0.008）（图4C、D)。此外，低风险组的无进展生存期也比高风险组长(图4E)。主成分分析显示训练和测试队列中低风险亚组与高风险亚组之间存在显著差异(图4F、G)。在训练集和测试集中，高风险组和低风险组的风险评分、生存状态以及风险标识的lncRNA表达之间存在显著差异(图4H)。

 

为了探索风险评分作为预后因素是否独立于其他临床特征的可能性，研究者进行了单变量和多变量Cox回归分析。结果显示风险评分(单变量Cox回归：HR = 3.097 (1.817−5.277)，P < 0.001；多变量Cox回归：HR = 2.971 (1.716−5.144)，P < 0.001)可以独立预测OS(图5A,B)。此外，我们构建了一个预测GBM患者0.5年、1年和2年生存(OS)的示意图(图5C)。校准曲线显示预测结果与实际结果良好一致(图5D)。对于1年、2年和3年的受试者工作特征曲线下面积(AUC)，分别为0.659、0.710和0.771(图5E)，这证实了风险评分的预测能力。此外，与其他临床特征相比，风险模型具有较高的AUC值，表明本模型具有很强的预测能力(图5F)。

 

图4 ICD相关风险签名的开发和验证

 

图5 风险评分的预后价值

 

4. 低风险和高风险亚组的突变景观和药物敏感性分析

为了探索高风险和低风险组之间的差异，研究者分析了体细胞突变数据。结果显示，高风险组的43个样本中有38个（88.37%）存在遗传突变，而低风险组108个样本中有98个（90.74%）存在遗传突变。(图6A,B)在低风险组中，TP53（33%）是突变频率最高的基因，其次是PTEN（30%）、EGFR（28%）和TTN（26%）。在高风险组中，PTEN（40%）是突变频率最高的基因，其次是TP53（33%）、TTN（33%）和EGFR（26%）。同时，在两组中，错义突变在变异分类中排名最高，SNP在变异类型中排名最高，C > T在SNV类别中排名最高。(图6C,6D)然而，两个风险组之间在肿瘤突变负荷（TMB）上没有显著差异，并且TMB与风险评分之间没有显著关系 (R = 0.044, P = 0.59)(图6E,F)。根据TMB的中位数，将患者分为高TMB组和低TMB组，生存分析显示，高TMB组的患者存活时间明显更长(P = 0.014）(图6G)。随后，作者进一步考虑风险评分。生存曲线显示，高TMB与高风险组、高TMB与低风险组、低TMB与高风险组以及低TMB与低风险组之间的存活预后存在显著差异 (P < 0.001)，表明除了TMB外，风险评分是GBM患者的独立预后因子(图6H)。此外，研究者进行了药物敏感性分析，评估了多种药物的IC50值，并发现对低风险和高风险组敏感的药物之间存在显著差异。

 

图6 低风险和高风险亚群的突变情况

 

5. 低风险和高风险亚组的免疫相关差异

研究者进一步分析了风险评分与肿瘤免疫微环境之间的关系。嗜酸性细胞与风险评分呈显著负相关（R = -0.25，P = 0.0017），而激活的CD4记忆T细胞、静息的CD4记忆T细胞以及M1型巨噬细胞与风险评分表现出显著正相关性(i)（分别为R = 0.22，P = 0.0054；R = 0.22，P = 0.0052；R = 0.23，P = 0.004）(图7A-D)。同时，肿瘤细胞干性评分与风险评分呈显著负相关(R = -0.31, P = 8.5e-05）(图. 7E)。所有的免疫相关功能和免疫细胞丰度在高风险和低风险组之间都存在显著差异。(图7F)这表明风险评分确实可以反映肿瘤的免疫状态。基于ssGSEA算法，箱线图显示了不同风险组中浸润免疫细胞群体的丰度(图7G)。另外，与低风险组相比，高风险组的TIDE得分显著高，这表明低风险组更可能从免疫疗法中受益(图7H)。此外，研究者从IMVIGOR210获取了免疫治疗队列。根据本风险模型，计算出每个患者的风险评分，并将其划分为低风险和高风险组。生存曲线显示，高风险和低风险组之间的整体生存(OS)差异并不显著。然而，有趣的是，研究者发现对免疫治疗反应良好的患者在低风险组，这与之前的预测一致，即低风险组更可能从免疫疗法中受益(图7G)。

 

图7 风险评分与免疫细胞、免疫功能和免疫治疗反应的相关性

 

6. ICD特征蛋白的表达水平

从HPA数据库获取了GBM组织和正常脑组织中ICD特征蛋白的免疫组化染色图像。HPA数据库的免疫组化结果显示，与正常大脑皮层组织相比，GBM肿瘤组织中IFNA1和MYD88的表达显著高于正常组织。这与研究者发现的结果是一致的。在研究者构建的模型中，IFNA1和MYD88都是GBM患者的预后风险因素(图8) 。

 

 

图8 基于IHC的4种ICD相关基因在GBM组织和正常脑组织中的表达。所有IHC染色图像均来自HPA数据库

 

文章结论与讨论，启发与展望

基于34个ICD相关基因，研究者成功地将GBM样本区分为两种ICD表达模式，并发现这两种模式的免疫微环境存在显著差异。随后，基于两种ICD模式之间的DEGs，研究者最终识别了4个ICD相关标签，并构建了具有良好诊断能力的ICD相关风险评分模型。此外，风险评分与免疫微环境、药物敏感性和肿瘤干性评分强相关。本研究进一步阐明了ICD在GBM中的可能机制，并证明了ICD与GBM预后和免疫治疗反应之间的关系。本研究为进一步开发ICD诱导剂提供了新思路，促进了GBM精准个体化免疫治疗的发展。