患者样本中存在的一些生物分子能够为疾病诊断提供关键的检测指标，例如疾病代谢物和蛋白质标记物。现有的分离方法通常采用沉淀法，费时昂贵且要条件优化。本文中，我们通过使用 NMR 和 Off-Gel 方法来进行评估，展示了如何通过超滤快速、精确、高效地分离血清中生物分子。
目前，人们普遍采用多重亲和去除系统(Multiple Affinity Removal System, MARS)从人血清、血浆和其他生物液体中分离高丰度蛋白质（白蛋白、IgG、抗胰蛋白酶、IgA、转铁蛋白和结合珠蛋白）。去除这些高丰度蛋白质可以有效地扩大动态范围，从而改善血清样本的LC/MS和电泳结果。但是，使用该系统会给用户带来高昂的成本（4×w.r.t.超滤）。
我们通过超滤的方式，以蛋白质的大小和结构为基础，在驱动力（通常由离心或压力条件产生）下将样品通过膜分离。
具体步骤如下
1
浓缩管制备
用 0.1NHCl冲洗Vivaspin® Turbo 4，重复冲洗 3 到 4 次。
2
样品采集、超滤和分析
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从患者身上抽取血样并提取血清
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使用 Vivaspin® Turbo 4，50kda MWCO PES（4000g，7min）高丰度血清蛋白
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使用 Vivaspin® Turbo 4，3kDa MWCO PES 浓缩滤液（4000g，7min）
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浓缩物的Off-Gel进行区带分离分离（蛋白质>3kDa）
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超滤透过液的核磁共振（代谢产物<3kDa）
以上步骤即可实现蛋白质从代谢物中分离，但是需要注意的是用去离子水进行预冲洗无法有效去除干扰物，因此在核磁共振图谱中观察到杂质峰（图1）。因此使用0.1NHCl溶液进行预冲洗（一个浓缩管的预冲洗量为12 ~ 14 mL，是Vivaspin® Turbo 4PES的 3 ~ 4 倍）。
图1. 核磁共振图谱
结论
通过Off-Gel分离对浓缩物进行分析（图2），含有小代谢物的滤液则通过核磁共振进行分析（图3）。因此超滤方式是简单高效的，对一个样本的分析成本估计会是MARS的四分之一。
（左）图2. 对健康个体（顶部）和患病个体（底部）的 血清中蛋白质进行的Off-Gel分离分析
（右）图3. 对健康个体（顶部）和患病个体（底部）血清中代谢物进行的核磁共振分析
