在肿瘤发生发展过程中，包括但不限于巨噬细胞、DC（dendritic cell）、中性粒细胞、B细胞、T细胞、CAF（tumor associated fibroblast）等多种细胞被招募到肿瘤细胞周围的微环境中，与ECM（extracellular matrix）等元素共同构成肿瘤免疫微环境TIME（tumor immune microenvironment）。

在TIME中的多种成分，包括T细胞、B细胞以及分泌的相关因子等虽然对肿瘤起着免疫作用，但还有许多其它成分，如细胞方面包括M2型巨噬细胞、Treg细胞、Th2细胞及MDSC （Myeloid‑derived suppressor cell）等发挥着免疫抑制的作用，细胞因子方面IL-4、IL-5、IL-10、TGFβ、MMP9和VEGF等等也通过特定的机制起着促进免疫逃逸和肿瘤发生发展的作用。在免疫的过程中，肿瘤细胞也衍生出了各种对抗免疫的机制，例减少抗原的表达，抑制DC细胞的抗原递呈能力，抑制细胞毒性T细胞的浸润等等。

在过去的十年里，虽然关于TIME的研究文章呈逐年递增的状态，TIME方向作为国自然研究的热点，提供了大量的基金支持，但鉴于TIME的复杂性以及癌症治疗的困难性、高复发率，对TIME的研究仍任重道远。在这里，小优博士又整理了两篇近期发表的关于TIME的高分文章，分别从研究背景、主要研究结果方面分享给大家，并对相关的研究思路做了部分总结，希望对大家的科学研究起到帮助作用。

骨肉瘤是最常见的骨肿瘤之一，主要发生在青少年。尽管在手术和化疗方面取得了很大的成就，但骨肉瘤患者的预后仍不理想。复发性骨肉瘤是临床的一大挑战，复发性骨肉瘤患者预后较差。因此，迫切需要深入探讨骨肉瘤的进展机制，加强对复发性骨肉瘤的认识。

肿瘤微环境(Tumor microenvironment, TME)主要由多种细胞类型和细胞外基质组成，与癌细胞相互作用，促进癌症进展。癌症相关成纤维细胞(CAFs)是TME中最常见的细胞，可通过癌症干细胞更新、免疫治疗疗效减弱和化疗耐药性导致癌症进展。然而，CAFs免疫抑制特征在OS中的作用和机制值得进一步研究。

单细胞RNA测序(scRNA-seq)是一种强大的新工具，可以检测遗传和功能异质性，重建细胞成分及其相互作用，并检测罕见的TME亚群。ScRNA-seq用于识别和分析OS的精确细胞簇和组成。然而，这些研究都集中在细胞成分上，并没有明确阐明TME在OS进展中的作用和机制。

本研究在前期研究GSE152048和GSE162454的基础上，利用scRNA-seq和生物信息学技术揭示CAFs在复发性OS TME中的调控作用。这可能在单细胞水平上促进对CAFs在复发性骨肉瘤TME中的作用和机制的理解，为骨肉瘤的治疗提供新的靶点。

首先，为了便于大家理解本文的研究思路，作者精心制作了一个研究流程图，如下：根据GSE152048(BC)和GSE162454(OS)的数据集，作者进行了scRNA-seq分析，以研究原发性、复发性和肺转移性骨肉瘤病变的细胞构成。GSE152048(BC)包括来自7个原发、2个复发和2个肺转移性OS病变的100987个细胞。GSE162454 (OS)包括29278个细胞，这些细胞来自6个原发性OS患者在接受新辅助化疗之前。此外，作者又使用三个配对的原发性和复发性OS样本，通过免疫荧光、预后分析等方法来验证scRNA-seq的结果。

文章研究路线图

经过数据分析发现，原发性、复发性和肺转移性OS病灶中鉴定出14种细胞类型(A)，且三种OS病灶的t-SNE图叠加，发现复发性OS病变的Div-CAFs(diverse CAF)较突出(B)。虽然细胞种类在三种类型的OS病灶中没有大的差异，但部分比例变化非常大，尤其是肿瘤相关成纤维细胞CAF，原发性与复发性的比例为3.58%和96.42% (C)，说明了复发性OS中，CAFs的浸润水平比较高。

对原发性和复发性OS病灶中对差异表达的HALLMARK基因进行通路富集分析，发现EMT（上皮间充质转化）通路相关基因在复发性OS组织中明显激活。

（a） WB检测发现与OS细胞相比，CAFs具有较高的N-cadherin ( EMT 的marker )表达和较低的E-cadherin表达。同样在复发性OS中，由于CAFs的浸润较多，N-cadherin表达也较高(A)。

（b） CAFs激活marker：(a-SMA：recombinant stromal cell derived factor 1，FAP: fibroblast activation protein) a-SMA和FAP在复发性OS组织中显著升高(B)。

（c） 通过TIMER数据库分析，FAP与EMT 的marker E-cadherin显著负相关，而与N-cadherin显著正相关(C)。

（d） IF实验补充表明复发性OS组织中的a-SMA表达高于原发骨肉瘤组织，E-cadherin表达较低(D)。