单细胞分泌细胞因子动态检测——ELISPOT

细胞因子(cytokine，CK)是由多种组织细胞(主要为免疫细胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，能够介导细胞间的相互作用，具有多种生物学功能，如调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等。

对细胞因子的研究具有非常重要的理论和实用意义：在基础免疫研究中，细胞因子检测是阐明分子水平的免疫调节机理的有效手段；在临床疾病诊断、疗效判断及细胞因子治疗检测方面，也具有重要价值。

目前细胞因子检测的方法主要有：生物学检测法、免疫学检测法、分子生物学方法。ELISPOT即是众多检测方法中，第一个能够在单细胞水平上对细胞因子进行动态检测的技术，可以从系统生物学的角度对细胞信号传导过程进行全新的解读^[1]。

分类	方法
生物学检测法	包括细胞增殖法、靶细胞杀伤法、
生物学检测法	细胞因子诱导的产品分析法和细胞病变抑制法等
免疫学检测法	WB、ELISA、ELISPOT、Luminex、CBA、MSD、Ab Microarray等
分子生物学方法	斑点杂交、Northern印记、细胞和组织原位杂交、PT-PCR等

表1：细胞因子检测方法

1983年由切尔金斯基（Czerkinsky C）等人引入^[2]，是单细胞水平功能性分析中使用最频繁、最广泛的技术；2003 国内Sars病毒肆虐，相关研究的增长使得该技术得到大规模的认识与引进，在后续的预防性HIV疫苗及HBV防止监控中被广泛应用。近年来Sars-Cov-2在世界范围内长期流行，相关研究也普遍采用ELISPOT方法对细胞免疫功能进行评估。

图1：检测结果示图

技术原理

ELISPOT（Enzyme-Linked Immuno Spot）是酶联免疫与斑点显色的结合：细胞受到抗原刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被 ELISPOT板底PVDF膜上（预包被的）的特异性单抗捕获。去除细胞后，被捕获的细胞因子与生物素标记的单抗结合，其后再与碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的亲和素结合。加底物显色后，PVDF 膜上出现的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过 ELISPOT Reader对斑点进行计数和分析。统计膜上的斑点数目,再除以当初加入孔内的细胞总数,就可以计算出阳性细胞的百分比。

图2：ELISPOT Workflow

我们可以通过与ELISA的对比更好地理解该技术：

_	ELISA	ELISPOT （单细胞水平的ELISA）
原理	都是基于抗原抗体反应，ELISPOT是双抗夹心ELISA的延伸和新的发展。
测定对象	蛋白含量	分泌细胞因子或抗体的细胞比率
样品板	普通96孔板	覆PVDF膜96孔板
灵敏度	+	+++
检测方式	酶标仪检测吸光度	酶联斑点分析仪成像分析
特点	目标细胞因子定量	活细胞功能的动态评估

表2：ELISA VS. ELISPOT

发展与优化

传统ELISPOT能够对一种细胞因子进行精准的动态检测，但无法应用于多个类型细胞因子的检测，因此科学家们在ELISPOT基础上进行技术扩展，推出了FluoroSpot（Ruedl C et. al., 1994; Sarawar SR et. al., 1994）——荧光斑点检测技术，以荧光团代替酶标，可实现双因子、三因子甚至四因子同时检测。

起初科学家们也尝试使用双色酶标的方法进行多因子检测，但无法避免双色斑点判读出现的误差——因子分泌量的差异会导致斑点显色程度不同，若出现高强度颜色的斑点，则会掩盖其他因子分泌产生的斑点，干扰最终判读结果。FluoroSpot以不同颜色的荧光进行标记，判读时通过滤光片遮蔽其他因子的显色，即可得到精准的目标荧光斑点，荧光之间互不干扰，是双因子、多因子ELISPOT检测理想的方法^[3]。

图3：三因子检测结果示图

除了检测因子的扩展之外，ELISPOT相关技术操作、板底材质、应用领域也在持续优化发展。

技术优势
活细胞分泌的细胞因子检测	最终在检测板上出现的斑点是细胞因子产生并累积的“印迹”，是动态分泌过程的最终体现。相较于ELISA对于已分泌细胞因子的静态检测，ELISPOT提供了全过程的动态视角，直观体现细胞免疫反应强弱，规避了假阳性细胞的误判。
极高的检测灵敏度	ELISPOT检测精度比传统ELISA高2-3个数量级，能从20万-30万细胞中检岀1个分泌该蛋白的细胞，是目前为止最为灵敏的检测技术^[4]。
高通量检测^[5]	实验在覆PVDF膜的96孔板中进行

结果直观可信	检测图中的斑点代表了分泌细胞因子的细胞，斑点晕的强弱与细胞因子分泌量一一对应。

技术应用概览