随着 mRNA 疗法的出现，可成药靶点的领域已经显著扩大，科学家需要极高的准确性来表征这些疗法及其预期效果。为此，微滴式数字 PCR（ddPCR）技术已被证明其优越的精度和绝对定量准确性，微滴式数字 PCR 正在改变 mRNA 治疗开发和制造领域。
通过引入基于 mRNA 的疗法，可成药靶标的范围大大扩展，这些疗法可以靶向任何蛋白质、肽或蛋白质片段的模板。此外，由于 RNA 充当 DNA 模板和效应蛋白之间的中介，因此它适用于从靶向遗传疾病治疗到疫苗开发的广泛应用（Qin, 2022）。例如，基于 mRNA 的疫苗提供了一种 mRNA 模板，可快速刺激针对病原体或癌细胞的免疫反应（Pardi, 2018）。
基于 mRNA 的有效疗法开发带来了独特的挑战。确保治疗的效力、保持 RNA 完整性以及准确表征 RNA poly A 尾巴的长度都至关重要，因此 RNA 组分和靶标的精确定量对药物生产至关重要。虽然传统的定量 PCR（qPCR）是一种常用方法，但它无法实现绝对定量，因为每次运行都需要新的标准曲线，从而可能给研发管线带来不确定性。
ddPCR 技术为开发 mRNA 治疗方法所需的精确 RNA 定量提供了一种解决方案。ddPCR 将样品分成 20000 个单独的液滴，每个液滴经过单独的 PCR 反应，可实现绝对定量和优越的精确度。ddPCR 检测具有检测低水平 RNA 的出色能力，是 mRNA 治疗开发和生产的最佳选择。
精确的给药剂量需要绝对定量
准确的 RNA 定量对于 RNA 疗法的成功至关重要。由于 RNA 分子本身是这些治疗产品中的“药物”，因此绝对定量对于确定药物安全性和有效剂量至关重要。任何错误都可能导致时间、资源和公众信心的重大损失。此外，研究人员需要评估在患者中观察到的 RNA 表达的精确变化，以确定治疗是否按预期进行。绝对定量在 RNA 治疗开发的每个阶段都至关重要。
利用终点 PCR 检测法可以确认 RNA 完整性
由于样本分配，ddPCR 提供了优越的精度，每个液滴都经过一次独立的 PCR 反应。这种独特的方法消除了对标准曲线的要求，使研究人员能够实现绝对的 RNA 定量，从而能够确定准确的给药剂量，提高可重复性，并在整个开发过程中节约时间。
ddPCR 的另一个重要优势是它们能够区分完整的核酸序列以确认其完整性，这是生产安全有效的 RNA 药物的关键因素。虽然传统的基于 PCR 的检测可以检测短 RNA 序列的存在，但它们无法表明这些序列是否来自更大的完整分子或降解的核酸。然而研究人员可以利用 ddPCR 获得清晰的数据指示是否存在完整的RNA序列，从而更好地评估治疗性RNA的完整性。
例如，Mello 等人（Mello, 2020）对 SARS-CoV-2 RNA 降解的研究表明，ddPCR 技术可以使研究人员通过确定特定序列是否同时存在于一个较大的核酸上来检测完整病毒基因组的存在。
使用 ddPCR 测定 poly A 尾的长度
除了核酸定量等常规应用外，ddPCR 技术还可用于测量 poly A 尾的长度。150-250 个核苷酸的 poly A 尾部存在于几乎所有内源性 mRNA 上，对 mRNA 的成熟、稳定和运输至关重要，去烯基化或去除 poly A 尾可以启动 mRNA 降解（Liu, 2022）。RNA 疗法和疫苗需要 poly A 尾来保护 RNA 药物免受降解并确保内源性翻译。
在开发基于 COVID-19 的 mRNA 疫苗时，辉瑞 /BioNTech 利用 ddPCR 检测来验证其产品 poly A 尾的完整性（Daniel, 2022）。辉瑞 /BioNTech 疫苗的广泛成功以及疫苗开发的时间轴证明了 ddPCR 技术在量化 mRNA 药物种微小但必不可少的成分方面具有重要性。
充分发挥 RNA 疗法的潜力
自问世以来，ddPCR 技术一直是绝对定量核酸的首选方法。基于 mRNA 的疗法面临着独特的挑战，例如准确定量和确保治疗性 mRNA 的完整性。行业领导者可以通过 ddPCR 技术优越的灵敏度和精确度来应对这些挑战，该技术也正在彻底改变 mRNA 疗法的发展。无论是检测稀有污染物、定量 RNA 药物，还是评估在宿主 RNA 水平的治疗效果，ddPCR 在 RNA 疗法开发的每个阶段都改变了游戏规则。
