阐述Munc18-1结构域3a特异氨基酸对其调控SNARE复合物组装和突触囊泡分泌的重要意义

突触囊泡分泌神经递质是介导神经元细胞之间物质运输和信号传递的关键步骤。装载神经递质的突触囊泡被转运到突触前膜上的活性区，经历锚定、成熟过程处于待释放状态。随后在Ca²⁺触发下，突触囊泡与突触前膜快速融合并释放内容物。SNARE蛋白是驱动大部分细胞融合事件的核心机器，神经元中，SNARE蛋白包括突触前膜上的Syntaxin-1和SNAP-25，以及突触囊泡上的Synaptobrevin-2。三种SNARE蛋白通过其SNARE基序组装形成四股螺旋结构，将囊泡膜和突触前膜不断拉近并最终介导两膜高效融合。SNARE复合物快速而正确组装是囊泡成熟的标志，这个过程依赖于多种蛋白协同作用和精细调控。Munc18-1作为SM蛋白家族重要一员，在突触囊泡分泌中起着十分重要的调控作用，并且发现Munc18-1上许多突变引起神经性脑病。因此，深入研究Munc18-1作用机制有助于更好理解神经递质分泌过程，进而为相关疾病治疗提供理论依据。

首先，研究者通过氨基酸定点突变在Munc18-1结构域3a的铰链环（loop）上将可能影响Munc18-1功能的氨基酸进行突变。通过非变性胶实验，发现T323A/M324A/R325A突变（TMR）严重破坏Munc13-1 MUN结构域催化的以Munc18-1/Syntaxin-1起始的SNARE复合物组装。这种抑制作用是否由于突变增强了Munc18-1与Syntaxin-1亲和力而引起？研究者通过GST pull-down实验揭示TMR突变未改变Munc18-1与Syntaxin-1的相互作用。接下来，研究者将Munc18-1/Syntaxin-1和Synaptobrevin-2蛋白分别重组到脂质体膜上，观察结构域3a上突变对脂质体膜融合的影响。在Munc13-1催化下， Munc18-1/Syntaxin-1与Synaptobrevin-2及SNAP-25组装SNARE复合物组装，介导脂质体融合，但是TMR突变导致脂质体融合失败。这些结果说明Munc18-1结构域3a铰链环上氨基酸（T323、M324、R325）对Munc18-1/Syntaxin-1转化到SNARE复合物过程十分重要。

图1. Munc18-1结构域3a上功能关键氨基酸筛选

接下来，研究人员在培养的小鼠大脑皮层神经元中通过RNA干扰技术敲低内源表达的Munc18-1，并回补表达野生型（WT）及突变体Munc18-1，利用全细胞膜片钳技术，记录结构域3a上突变对神经递质分泌的影响。发现结构域3a上突变严重破坏神经元的自发微小抑制性突触后电流（mini IPSC）和动作电位诱发的抑制性突触后电流（evoked IPSC）。这些结果表明结构域3a上突变对突触囊泡分泌十分重要。进一步实验发现该突变既不影响Munc18-1在神经元细胞中的表达及转运，也不影响突触形成。因此，研究人员推测是否这些氨基酸在突触囊泡启动过程中发挥作用？于是，研究人员通过高渗蔗糖触发已成熟的抑制性突触囊泡释放（surcose IPSC），通过统计其电荷转移量，来揭示突变对神经元可释放囊泡库大小的影响。结果发现突变不能够恢复Munc18-1敲低引起的可释放囊泡库的减小。这些结果说明结构域3a上氨基酸突变通过破坏突触囊泡启动过程从而抑制囊泡分泌。由于囊泡启动过程的本质是SNARE复合物组装，因此体内和体外结果是一致的。

图2. Munc18-1关键氨基酸突变严重破坏神经突触囊泡分泌

体外和体内实验结果共同表明结构域3a对Munc18-1/Syntaxin-1转化到SNARE复合物过程及囊泡成熟过程至关重要。但是其具体作用机制是什么？之前研究表明Munc18-1结构域3a构象伸展后能够识别并结合Synaptobrevin-2和Syntaxin-1的SNARE基序区（SNARE motif），将其在空间上拉近（称为模板功能），从而促进SNARE复合物组装，破坏两种相互作用都将抑制SNARE复合物组装。从结构上分析氨基酸T323、M324、R325位于伸展的铰链环底部，是否这些氨基酸参与结合Synaptobrevin-2？因此，研究者检测了单独Munc18-1与Synaptobrevin-2的相互作用。在脂质体上重组SNARE蛋白，Munc18-1通过与Syntaxin-1及Synaptobrevin-2相互作用，从而促进SNARE复合物组装，进而促进脂质体融合，结果发现突变体与野生型Munc18-1都可以促进脂质体融合。接下来，研究者通过GST pull-down实验直接监测Munc18-1与Synaptobrevin-2之间的相互作用，发现突变不影响Munc18-1与Synaptobrevin-2结合。这些实验结果共同表明当Munc18-1单独存在时，TMR突变不影响Munc18-1结构域3a构象倾向于伸展的趋势及Munc18-1与Synaptobrevin-2的结合。

图3. Munc18-1关键氨基酸突变不影响单独Munc18-1与Synaptobrevin-2结合

Munc18-1与Syntaxin-1紧密结合形成复合物，此时Munc18-1结构域3a的铰链环卷曲向上，Syntaxin-1铰链区形成闭合构象，从而使Syntaxin-1无法参与SNARE复合物组装。在Munc18-1/Syntaxin-1向SNARE复合物转化中，Munc18-1结构域3a构象由“卷曲”到“伸展”，Syntaxin-1铰链区由“闭合”到“打开”，两种构象变化对转化能否正常进行至关重要。单分子荧光共振能量转移（smFRET）实验表明TMR突变不影响Munc13-1 MUN结构域诱导Syntaxin-1铰链区构象发生变化。Munc18-1/Syntaxin-1中，Munc18-1结构域3a处于卷曲构象，抑制结构域3a与Synaptobrevin-2结合，Munc13-1 MUN结构域诱导Syntaxin-1铰链区打开，结构域3a随之伸展，Synaptobrevin-2结合到结构域3a上。因此，研究者通过GST pull-down实验监测Synaptobrevin-2能否结合到Munc18-1/Syntaxin-1复合物上来揭示TMR突变是否影响结构域3a构象变化。结果发现MUN结构域存在条件下，TMR突变导致Synaptobrevin-2无法与Munc18-1/Syntaxin-1相互作用，由于TMR突变不影响单独Munc18-1与Synaptobrevin-2结合，因此可以得出结论，Syntaxin-1铰链区打开之后，TMR突变导致卷曲的结构域3a不能伸展，从而不能正常发挥模板功能。

图4. Munc18-1关键氨基酸突变选择性抑制Munc18-1结构域3a构象伸展

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究综合利用生物化学、细胞生物学、电生理和单分子FRET等实验方法，鉴定了Munc18-1结构域3a上控制其构象变化的关键氨基酸。阐明了Munc18-1/Syntaxin-1向SNARE复合物转变过程中，这些关键氨基酸改变将导致结构域3a无法正常发生构象变化，使Munc18-1不能发挥模板功能，导致SNARE复合物组装失败和囊泡成熟受阻，神经递质无法正常释放。这项工作进一步阐明了Munc18-1蛋白调控SNARE复合物组装和突触囊泡分泌的分子机制，为神经疾病治疗及药物研发提供理论依据。该项研究也进一步丰富了研究团队在Munc18-1和Munc13-1协同调控神经递质分泌领域的观点。