以胆固醇代谢为靶点开发针对脑胶质瘤的新型溶瘤病毒疗法

胶质母细胞瘤(GBM)是恶性程度最高的颅内肿瘤。目前，GBM的治疗方式以手术切除为主，放疗、化疗等综合治疗为辅。然而，接受这些传统治疗的患者的中位生存期不足两年并且伴有高度复发风险[1]。近年来，免疫疗法在外周肿瘤中所取得的突破性进展，以及中枢神经系统(CNS)淋巴循环通道的发现，使得 GBM的免疫治疗成为可能[2]。然而，已有的研究表明即便 GBM 可以被免疫系统识别，其多方位的免疫耐受或逃逸机制使得免疫疗法难以在 CNS 内激发持久的抗肿瘤免疫反应[3，4]。因此，阐明胶质瘤的免疫耐受机制对于寻找有效的治疗方案至关重要。与外周肿瘤不同的是，大脑在解剖上的差异使其形成了独特的肿瘤代谢(包括脂质、糖、氨基酸)特征。特别是 GBM 细胞所需要的胆固醇主要依赖外源性摄取胆固醇而非自身从头合成。越来越多的研究表明，肿瘤微环境胆固醇代谢紊乱在肿瘤恶性进展、免疫逃逸和治疗抵抗中发挥重要作用[5，6]。因此，阐明 GBM 微环境胆固醇代谢紊乱的机制，并对其进行精准修正，有可能突破 GBM 免疫治疗耐受的困境。

研究者首先观察到，GBM肿瘤组织中的总胆固醇含量高于普通脾脏组织，但低于正常脑组织（图1a）。但是，GBM肿瘤间质液中的胆固醇水平显著高于正常脑组织间液中的水平（图1b），且主要形式为高密度胆固醇（图1c），这说明胆固醇在TME中被重新分配和富集。在GBM患者组织芯片中发现，与相邻组织相比，GBM组织中的ApoE水平更高（图1d）。在颅内小鼠GBM模型中，研究者发现ApoE在GBM肿瘤组织边缘积聚，其显著高于邻近组织（图1e）。这些发现表明，由于代谢相互依赖，GBM细胞在TME中形成胆固醇库（图1f）。

图1GBM微环境的细胞间质液中胆固醇异常累积

进一步发现，高胆固醇微环境导致巨噬细胞中积累了大量未清除的吞噬小体（图2a）；胆固醇增加使髓系来源的巨噬细胞（BMDMs）吞噬能力减弱，而使用降低胞内胆固醇的小分子激动剂LXR-623能够增强巨噬细胞的吞噬功能（图2b）；作者同时观察到“别吃我”信号分子Siglec-10和PD-1的表达水平与胆固醇含量呈正相关；在GBM患者和小鼠GBM样本中，Siglec-10+/PD-1+TAMs的胆固醇水平显著高于Siglec-10-/PD-1- TAMs（图2c, d）。免疫荧光进一步证实了从颅内GL261模型中分离的TAMs的胆固醇和siglec-10的共定位（图2e）；相比脾脏组织分离的巨噬细胞，肿瘤浸润巨噬细胞胆固醇水平增高、Siglec-10和PD-1的表达上调（图2f）。

图2GBM组织中，胆固醇异常增高促进TAM细胞“别吃我”信号

作者发现载脂蛋白A1（ApoA1）能够降低TAMs中的胆固醇（图3a），且显著增强TAMs的吞噬作用，这种促吞噬作用能被ABCA1的抑制剂阻断（图3b）；在肿瘤内的ApoA1浓度升高，能够降低原位GBM中的Filippin^high/Siglec-10^high和Filippin^high/PD-1^highTAMs（图3c）。为进一步阐明代谢重新编程对巨噬细胞的影响，作者检测了TAMs的炎症和极化，包括TNF-α和iNOS的产生以及主要组织相容性复合体MHC-I/II的表达（图3d），发现iNOS均无变化，而TNF-α在GL261^APOA1的TAMs中略有增加，但在G422^APOA1的TAMs中无变化。然而，ApoA1使TAMs上MHC-I和MHC-II的表达量显著上调，并激活抗肿瘤免疫（图3e&3f）。这些结果说明ApoA1诱导的胆固醇代谢变化使TAMs的吞噬功能得到恢复，进而促进抗肿瘤免疫反应（图3g）。

图3 ApoA1蛋白能够降低TAMs的胆固醇水平

进一步的转录组分析显示，ApoA1使TAMs脂质代谢相关通路显著下调（图4a，b），调节甾醇代谢的通路下调尤为明显（图4c）；胆固醇靶向代谢组学分析发现，在ApoA1显著减少TAMs中的胆固醇和氧化甾醇衍生物，包括7-酮基胆固醇（7K-Cho）和24（S），25-环氧胆固醇（图4d–f）。这些发现表明ApoA1重新编程了TAM的脂质代谢，导致胆固醇及其代谢产物的减少。机制上，ApoA1上调TAMs线粒体翻译相关基因（图4g），使其有更大的线粒体和更多的线粒体基质（图4h），表明ApoA1促进胆固醇外排能够缓解TAMs胆固醇应激，使其具有更活跃的线粒体新陈代谢。相反，胆固醇或肿瘤组织间质液TIF处理BMDMs，则显著下调参与线粒体RNA代谢的15个基因中的12个（图4i）；同样地，胆固醇特别是7K-Cho，能够显著降低BMDM中线粒体蛋白质含量和线粒体数量（图4j，k）。这些结果表明，巨噬细胞中胆固醇，特别是7K-Cho的积累会导致线粒体翻译障碍。7K-Cho处理导致线粒体蛋白的平均泳道强度较低，特别是在10–35 kDa分子量范围内，包括线粒体基质中的酶和附着在线粒体膜表面的外周蛋白，如NAD（P）转氢酶（11 kDa）和细胞色素C（10–13 kDa）；7K-Cho处理从BMDM中分离的线粒体，能观察到线粒体基质的空化和缺失（图4m），以及BMDM中膜电位的损失（图4n）；而用过量的7K-Cho处理则抑制了ApoA1对TAMs吞噬功能的恢复（图4p）。

图4 ApoA1能够减少胆固醇代谢物7-酮基胆固醇对线粒体翻译的抑制

最后作者巧妙构建了一个过表达ApoA1的溶瘤腺病毒（AdV^APOA1），瘤内注射AdV^APOA1能够显著抑制小鼠GL261原位肿瘤的生长，并延长小鼠生存时间（图5a）；AdV^APOA1在人源化小鼠荷载人胶质瘤原位模型中，也显著提高了治愈率（图5b）；进一步的机制研究表明，瘤内注射AdV^APOA1能够增强巨噬细胞的吞噬能力（图5c），上调其MHC II分子的表达水平（图5d）；显著增加T细胞浸润（图5e）及CD44表达、IFN-γ和颗粒酶B的产生（图5f），显著降低GBM浸润CD8+ T细胞的PD-1、LAG-3和TIGIT的表达（图5g）。总之，研究结果表明，肿瘤内给予AdV^APOA1能够高效重新编程TAM胆固醇代谢来增强抗肿瘤免疫应答（图5h）。

图5AdV-ApoA1能够促进巨噬细胞吞噬，增强抗肿瘤免疫应答。

文章结论与讨论，启发与展望

在这项研究中，作者确定了 GBM 微环境胆固醇累积导致 TAMs 吞噬脆性的潜在机制，并强调了在 GBM 免疫治疗中调控胆固醇代谢来共同调节肿瘤浸润性 T 细胞和 TAMs 的重要性。作者针对该靶点开发的表达APOA1的溶瘤腺病毒，在多种胶质瘤模型中显示出良好的抗肿瘤效果；且在叙利亚仓鼠和恒河猴中显示了良好的安全性，是一种极具临床转化潜力的肿瘤生物治疗药物。