首先，研究人员对532个粪便样本（270名CRC患者和262名健康对照者）的CRC宏基因组数据集进行多队列分析，发现C. maltaromaticum在女性CRC患者中减少，但在男性CRC患者中没有观察到改变。TCGA队列数据分析发现，女性CRC患者肿瘤内C. maltaromaticum的丰度越高，病人预后越好，而这一变化在男性CRC患者中并不显著。另外，C. maltaromaticum的丰度在人群粪便样本中可检测到的5733种细菌物种中排第803位。这些结果表明C. maltaromaticum是人类肠道微生物群中的益生菌，并可能对CRC具有性别特异性的保护作用（图1）。

图1  C. maltaromatium在CRC患者的粪便样本中以性别特异性的方式被耗尽。

为了探究C. maltaromaticum是否以性别依赖的方式发挥抗CRC效应，研究人员给雌性和雄性Apc^min/+小鼠（一种生殖细胞突变的肠道肿瘤发生模型）每天口服C. maltaromaticum并持续12周，对照组给予等体积的脑心浸液肉汤(BHI)或等量的大肠杆菌。结果表明与BHI或大肠杆菌给药相比，C. maltaromaticum处理的雌性小鼠的肿瘤大小明显减小。处死小鼠取出肠道组织发现，只有在C. maltaromaticum处理的雌性Apc^min/+小鼠结肠和小肠中观察到肿瘤数量显著减少，而在雄性小鼠中没有观察到这种现象（图2）。同样地，作者在AOM诱导的CRC模型中也观察到了类似的现象。这些结果表明，C. maltaromaticum可以以雌性特异性的方式抑制肠道肿瘤发生。

图2  C. maltaromaticum以雌性特异性的方式抑制肠道肿瘤发生。

为了研究C. maltaromaticum抗CRC作用是否依赖于雌激素，作者通过对雌性Apc^min/+小鼠进行卵巢切除术（OVX）建立雌激素剥夺的CRC模型。紧接着，接受了OVX或假手术的小鼠每天口服C. maltaromaticum、大肠杆菌或BHI。内窥镜检查显示，在接受C. maltaromaticum处理的假手术小鼠中，肿瘤明显减小，但接受C. maltaromaticum处理的OVX小鼠并没有观察到这种现象（图3）。同时，研究人员对雌性Apc^min/+小鼠进行OVX的同时补充17β-雌二醇来恢复雌激素水平。结果显示在补充17β-雌二醇后，C. maltaromaticum的抗CRC作用得到恢复。此外，作者还通过睾丸切除术（ORX）加上17β-雌二醇给药来使雄性Apc^min/+小鼠雌性化。一致地，在接受C. maltaromaticum处理的雌性化小鼠中观察到肿瘤减小，而在接受C. maltaromaticum处理的假手术雄性小鼠中没有观察到这种效果，表明C. maltaromaticum抗CRC作用确实依赖于雌激素。

图3  C. maltaromaticum通过雌激素抑制CRC进展。

为了研究雌激素如何影响C. maltaromaticum的定植，研究人员预先使用17β-雌二醇处理正常结肠上皮细胞NCM460，观察到17β-雌二醇显著增加了C. maltaromaticum对NCM460的附着。为了确定介导C. maltaromaticum附着到肠道上皮细胞的宿主受体，作者进行了通过western blot结合质谱实验鉴定出了三个膜蛋白，即SLC3A2、EF-hand结构域含有蛋白D2和galectin-3。然而，只有SLC3A2在其启动子中具有预测的ESR1结合位点，表现出性别特异性表达模式。随后，作者通过分析TCGA数据集，验证出SLC3A2与肿瘤内C. maltaromaticum的丰度呈显著正相关（r = 0.18；p = 0.019）。一致地，人类结肠中SLC3A2表达在女性中也显著高于男性（图4）。重要的是，SLC3A2的沉默抑制了C. maltaromaticum对NCM460的附着。此外，将C. maltaromaticum与NCM460共孵育本身并不诱导SLC3A2的表达。这些观察结果表明，作为一种跨膜糖蛋白，SLC3A2可能是C. maltaromaticum的受体。

图4 雌激素能促进C. maltaromaticum依赖SLC3A2受体定植于肠道上皮细胞。

肠道屏障功能障碍和细菌转位能促进CRC发生发展。基于此，研究人员通过使用AOM/DSS诱导的CRC小鼠模型，研究了C. maltaromaticum抑制肠道肿瘤发生过程中肠道通透性随时间的变化情况。结果显示，即使在无肉眼肿瘤可见的最早时间点，C. maltaromaticum也能显著降低血清葡聚糖水平，表明C. maltaromaticum改善肠道通透性早于抑制肠道肿瘤发生。同时，C. maltaromaticum处理的AOM/DSS诱导的结肠组织中的总细菌负荷也减少了，表明细菌进入上皮细胞的减少与C. maltaromaticum的抑制肿瘤效应相关。此外，C. maltaromaticum灌胃显著增加了Apc^min/+小鼠结肠紧密连接蛋白Tjp1（ZO-1）、Ocln（Occludin）和Cdh1（E-cadherin）的表达。C. maltaromaticum灌胃的Apc^min/+小鼠血清脂多糖（LPS）水平也显著降低（图5）。透射电子显微镜和Alcian蓝/周期酸-希夫染色进一步证明C. maltaromaticum减少了细胞间连接的宽度，并增加了含粘液层的厚度。一致地，在AOM诱导的CRC模型中观察到C. maltaromaticum增加了紧密连接基因的表达和粘液层的增厚。这些结果表明C. maltaromaticum能维持肠道的屏障功能，抑制炎性反应。

图5  C. maltaromaticum可以保护肠道屏障功能并抑制炎性反应。

进一步，研究人员通过液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）对Apc^min/+小鼠的粪便代谢物进行了分析，观察到维生素D代谢物显著富集。代谢通路分析表明，“维生素D3代谢”是C. maltaromaticum处理的Apc^min/+小鼠中最富集的通路之一，C. maltaromaticum显著增加了结肠中25-OHVD3/1,25(OH)2VD3浓度。

为了确定维生素D相关代谢物是否由C. maltaromaticum直接产生，作者对C. maltaromaticum的培养基进行了代谢谱分析，并发现7-去氢胆固醇（7-DHC；维生素D的上游前体），但没有其他维生素D相关代谢物。因此，作者推测其他肠道微生物对于诱导维生素D相关代谢物和C. maltaromaticum的抗肿瘤效应是必要的。随后，研究人员在AOM诱导的无菌CRC小鼠体内给予C. maltaromaticum，结果表明C. maltaromaticum在无菌小鼠中未能产生任何显著的抗CRC效应，对Apc^min/+小鼠粪便样本进行微生物组分析，以确定C. maltaromaticum是否改变了肠道微生物组成。已报道具有丁酸产生能力的Faecalibacterium prausnitzii和Lachnispiraceae bacterium在C. maltaromaticum灌胃小鼠中显著富集；相反，包括Bacteroides vulgatus和Muribaculum intestinale在内的机会性病原菌显著减少。值得注意的是，丁酸产生菌丰度与1,25(OH)2VD3浓度之间存在正相关关系，提示C. maltaromaticum可能通过调节肠道微生物组合进行维生素D生物合成。接下来研究人员利用体外发酵系统等实验验证了C. maltaromaticum通过调节F. prausnitzii来促进维生素D的合成。

通过RNA测序（RNA-Seq）鉴定的差异表达基因的基因集富集分析（GSEA）揭示了C. maltaromaticum处理的Apc^min/+小鼠结肠组织中VDR信号通路的显著富集。这一发现在TCGA队列中得到了验证，其中CRC患者的肿瘤内C. maltaromaticum丰度较高的患者表现出较高的VDR mRNA水平（已知维生素D3以正反馈方式诱导VDR表达）。一致地，在C. maltaromaticum处理的Apc^min/+小鼠结肠组织中验证了VDR的上调。通过Cramp（VDR靶基因）的增加和C. maltaromaticum处理的Apc^min/+小鼠结肠组织中VDR的核转位进一步证实了VDR的激活。

最后，作者使用TEI-9647和CRISPR敲除技术来抑制VDR以确定C. maltaromaticum对CRC的抑制作用是否依赖于VDR。通过重复上述各种表型体内外表型实验后发现，C. maltaromaticum的抗CRC效果在抑制VDR后完全消失（图6）。这些数据表明C. maltaromaticum的抗CRC效应依赖于VDR。

综上，本研究鉴定出了一种能影响结直肠癌进展的益生菌 - C. maltaromaticum，发现其能以雌激素依赖性地方式通过SLC3A2-VDR信号来抑制女性结直肠患者的发生发展，因此该研究为结直肠癌治疗提供了新的思路。