戊型肝炎是一种由戊型肝炎病毒（HEV）引起的全球性传染性疾病，主要通过粪口途径传播。它会导致肝炎症状，可以感染人类、以及猪和兔子等动物，并可通过这些动物传播给人类，在全球的发病率不断上升[1]。Cas13是一种靶向RNA的CRISPR/Cas效应器，通过特异性结合和切割RNA显示出其特有的抗病毒活性。其中Cas13d是VI-D亚型效应器，相比其他VI型变体，在抑制RNA病毒方面表现出更高的效率，尤其适用于使用AAV载体进行传递[2]。然而，Cas13d系统干扰哺乳动物体内RNA病毒的活性尚不清楚，因此，利用Cas13d结合AAV体内递送系统开发新的戊型肝炎治疗方法。

为了评估病毒mRNA的抑制效果，本研究使用mCherry荧光蛋白融合HEV3-ORF构建报告系统。结果显示，crRNA1、crRNA2、crRNA3和crRNA6的干扰效果显著（p < 0.0001），荧光强度显示出mCherry荧光被有效抑制（图1A、B）。本研究鉴定出靶向HEV3基因组高效crRNA，并证明Cas13d能够高效干扰RNA。

为了更好的检测CRISPR/Cas13d系统在沙鼠体内的抗病毒能力, 本研究建立并优化了HEV感染沙鼠模型，使用5E+5 copys/mL的病毒通过腹腔注射沙鼠（图1C）。同时本研究选择了3E+12GC/mL剂量的AAV8进行体内递送。通过检测Cas13d mRNA表达和免疫荧光分析确认了AAV8成功将Cas13d送达沙鼠肝细胞中（图1D、E、F）。通过RNA-seq检测了Cas13d的特异性，结果显示没有显著的脱靶效应（图1G）。本研究建立了一个利用AAV8递送Cas13d和特定HEV crRNA序列的抗病毒平台。

为了评估Cas13d在预防病毒感染中的作用，将包装有Cas13d:crRNA的 AAV8注射到沙鼠体内，随后检测GDC9病毒感染。结果显示，HEV感染被显著抑制（图1H、I）。肝脏组织学分析显示，与仅接受GDC9注射组相比，接受Cas13d:crRNA装载 的AAV8注射的沙鼠肝脏炎症和坏死减少（图1J，K）。免疫组织化学分析证实，注射Cas13d:crRNA的AAV8组的病毒载量较低（图1L，M）。

随后，评估了Cas13d治疗戊型肝炎感染的效果。结果显示，在仅接受GDC9注射的组中观察到较高的排毒率，而注射Cas13d:crRNA的AAV8组在经过11天后排毒率迅速下降（图1N）。肝功能检测和组织学显示，Cas13d 系统在治疗戊型肝炎方面是安全且有效的（图1O、P、Q）。免疫组织化学分析显示，注射Cas13d：crRNA的AAV8 组病毒载量显著较低（ 图 1R、S）。

此外，该研究还探讨了Cas13d系统缓解肝损伤的机制。肝转录组数据分析差异表达基因富集于NOD样受体信号通路、病毒蛋白相互作用、Th17细胞分化以及脂质和动脉粥样硬化途径等途径，显示与炎症、抗病毒反应和脂质代谢相关的基因发生了显著变化（图1T）。

图1 CRISPR-Cas13d系统用于预防和治疗沙鼠肝炎。