开发Retron介导的多重基因组编辑和进化系统

随着人们对基因治疗、代谢工程和合成生物学的日益关注，对新型高效基因编辑工具的需求随即不断扩大。经典的基因工程方法依赖于同源定向修复，并且通常与噬菌体衍生的重组酶（例如RecET或Lambda Red）结合以提高重组效率。然而，这些方法往往效率低下，最常用的Cre/loxP和FLP/FRT系统会在基因组中留下疤痕，阻碍了它们在基因工程中的广泛应用。为了高效构建无瘢痕突变菌株，最近开发了利用特定核酸酶的基因组编辑工具。其中包括锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活子样效应核酸酶（TALENs）和簇状规则间隔短回文重复相关核酸酶（CRISPR）。与ZFN和TALENs相比，CRISPR介导的编辑只需要改变不同靶点的短单引导RNA（sgRNA）的序列。因此，CRISPR已迅速成为最常用的编辑方法之一，几乎在所有生命领域都有应用。虽然目前已有多种基因组编辑技术，但对原核生物中任意目标序列动态且连续突变的技术却很少。

通过对Retron介导的基因组编辑系统的优化，开发了高效的基因组编辑工具，并将其应用于多重基因组编辑、可示踪突变文库的建立以及基因特异性的体内连续进化。该研究提出了一种高效的、多功能的Retron介导的基因组编辑系统（Retron-mediated genome editing system, REGES）。首先，通过对REGES的系统性优化，单位点、双位点、三位点和四位点同时编辑的效率分别达到~100%、85 ± 3%、69 ± 14%和25 ± 14%。此外，还利用REGES生成含有简并RBS序列的突变文库，以微调内源和外源基因的表达水平，如通过全局转录因子工程改善乙醇耐受性和生物素合成。最后，通过结合Retron、聚合酶介导的碱基编辑和易错转录，开发了REGES介导的体内蛋白质连续进化系统。这些研究证明了REGES是一种强大的多重基因组编辑和连续进化工具，在合成生物学和代谢工程中有着广泛的应用。

图1 REGES及其应用

1.REGES的介绍

Retron是细菌基因组中编码逆转录酶和非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）的遗传元件。Retron的逆转录酶是人类发现的第一个由细菌编码的逆转录酶，该逆转录酶可特异性识别msr和msd转录形成的二级结构，并逆转录产生RNA-ssDNA杂交分子，即msDNA（也称多拷贝ssDNA）。若将模板序列插入至msd中的适当位置，即可产生带有目标突变的多拷贝ssDNA，随后该ssDNA作为同源重组模板被整合至基因组中（图2）。与CRISPR、MAGE等离散的编辑方法不同，REGES的编辑是连续的。为提高同源重组效率，以多顺反子的形式过表达了来自Lambda噬菌体的单链退火蛋白bet（图2）。

图2 Retron介导的基因组编辑

2.系统性优化REGES并用于精确的基因组编辑

早在2014年，在SCIENCE上报道了Retron编辑系统，然而，可能是由于过低的编辑效率，并未引起广泛重视。近两年来，随着对Retron结构的解析以及编辑系统的改造，逐渐提高了Retron介导的基因组编辑效率，但目前仍缺乏系统性的研究工作。为此，本研究从宿主改造（内源性核酸酶敲除）、Retron生物元件优化（复制、转录和翻译调控）和编辑条件优化三个方面系统性地探索了影响REGES编辑效率的关键因素。经系统性优化后，获得了多个高效的Retron编辑载体，突变效率接近100%（图3）。除了在基因组引入碱基突变外，REGES还可用于碱基的插入、删除或各种突变类型的组合（图4）。长达50 bp的碱基可经REGES插入至基因组的特定位点，而可替换（140 bp）或者删除（5000 bp）的碱基数量则更多，突变效率与突变片段的大小相关。

图3 REGES的优化

图4 REGES的表征

3.REGES用于多重基因组编辑

多重编辑对合成生物学和代谢工程应用具有重要意义，经过系统优化后，进一步表征了基于REGES的多重基因组编辑能力。为尽量减少重复DNA串联导致的不稳定性，使用了两种不同的REGES构建：FAB45-Retron和FAB46-Retron,并将第一个REGES表达盒的T7终止子替换为L2U5H11，从而降低了相邻表达盒的同源性。同时编辑两个、三个和四个位点的效率分别达到了85 ± 3%、69 ± 7%和25 ± 14%（图5），为大肠杆菌单轮基因组编辑中可引入的最大的精确碱基突变数量。

随后，为促进连续或迭代基因组编辑，在REGES编辑质粒上进一步引入了归巢内切酶I-Sce I介导的质粒消除系统，可在3 h内实现100%的质粒丢失效率。最后，利用REGES构建了番茄红素高产菌株，以验证其精确编辑、质粒消除和多重编辑的能力。双重编辑和四重编辑产生的高产菌株分别使番茄红素的产量提高了3.9倍和4.5倍。多重编辑使得仅需2天即可构建包含5个位点突变的工程菌株，表明了REGES在微生物细胞工厂构建中省时、高效的特点。

图5 REGES用于多重基因组编辑

4.REGES用于生成可示踪的简并突变文库

由于REGES可在较长的突变窗口内引入突变，有望用于在基因组上整合可示踪的简并突变文库，从而获得理想的突变体，如通过简并的RBS序列调控内源或外源蛋白的表达水平（图6）。作为概念验证，利用REGES，将基因组整合的RFP表达盒的初始RBS（pET-RBS, TAAGAAGGAGA）替换为简并RBS序列(NNNNNNNNNNN)。在Retron文库的作用下，RFP的表达水平可在较广的范围内（208倍）精细调控（图6）。

先前的全局转录机器工程（global transcription machinery engineering, gTME）通过全局转录因子的定向进化增产代谢物、提高蛋白表达或改善耐受性。为探索对全局转录因子表达水平的调控同样是否可产生全局转录水平多样性从而应用于菌种改造，利用7个Retron文库调控了大肠杆菌7个全局转录因子（CRP、FNR、ArcA、IHF、HNS、FIS、LRP）的表达水平。以乙醇耐受表型作为研究对象，发现在高浓度乙醇（50 g l^-1）下生长的突变体均具有更低的FNR表达水平（图6）。此外，由于独特的RBS序列即可作为示踪条形码，REGES可快速建立突变株基因型和表型对应关系。除了在K系大肠杆菌菌株（MG1655）验证该系统外，在B系的菌株BL21（DE3）中同样进行了REGES介导的转录因子工程试验，用于高附加值代谢产物生物素的产量提高。通过表征生物素高产菌株，发现均提高了转录因子iscR的表达水平（图6），与文献报道的iscR对生物素产量影响的结果一致。

图6 REGES用于生成可示踪的简并突变文库

5.REGES用于基因特异性的体内连续进化

不同于先前的ssDNA介导的基因组编辑和进化系统（如MAGE），其ssDNA在体外合成并产生多样性。REGES的ssDNA凭借DNA依赖的转录和RNA依赖的逆转录在体内产生，意味着可通过DNA和/或RNA引入随机突变，从而产生包含随机突变的ssDNA。因而，本研究建立了一个正交转录系统，其中msr和msd的转录由与来自Petromyzon marinus的胞嘧啶脱氨酶融合的易错T7 RNA聚合酶驱动（PmCDA1-epT7RNAP），这使得随机突变可被引入至DNA模板以及转录的RNA。为便于检测突变并评估突变效率，将经典的反筛选基因sacB整合至大肠杆菌基因组。经过四轮的突变累积（8 h/轮），突变效率达到2.4 ± 0.076*10^-3（图7），是sacB自发突变效率的1000倍。在对蔗糖筛选平板上的突变株测序分析后发现了几个高效突变的位点：Q230、Y237和D247（图7），说明这些位点对sacB的活性具有极大影响。分析发现Q230位点突变产生提前终止的密码子，导致sacB失活。D247位于sacB的活性位点，研究表明，该位点的突变导致Kcat降低75-3500倍。此外，定点突变结果表明，Y237的突变会影响sacB的催化效率。

与目前最新的体内突变方法EvolvR（最长56 bp的突变区）相比，REGES具有更长的突变窗口（＜300 bp），考虑到突变窗口大小，REGES适于在体内连续进化蛋白的特定结构域或小的调控蛋白。尽管TRACE（或MutaT7、eMutaT7）可以在体内连续进化目的蛋白，但由于需要T7启动子和T7终止子的识别，这些系统更适合于进化整个外源基因，而REGES则可以进化任意启动子引导的蛋白，此外，由于REGES序列选择的灵活性，理论上可用于任意蛋白的任意区域的进化。REGES为体内连续进化提供了更多选择。

图7 REGES用于基因特异性的体内连续进化

文章结论与讨论，启发与展望

本文建立了用于多重基因组编辑和体内蛋白连续进化系统REGES。对REGES进行系统性优化后，单位点、双位点、三位点和四位点的同时编辑效率分别达~100%、85 ± 3%、69 ± 14% 和 25 ± 14%。此外，REGES还能生成含有可示踪的简并RBS序列的变体文库，以微调内源和外源基因的表达水平。最后，利用REGES与T7 RNAP介导的碱基编辑和易错转录相结合，实现了基因特异性的体内连续进化。REGES可用于快速构建微生物细胞工厂以及其他合成生物学应用。