简易有效制备靶基因双等位基因敲除的原代人T细胞克隆方法

T细胞是人体免疫系统的重要组成成分，在激活和调控免疫系统中起到至关重要的作用。研究目标靶基因（Gene of interest）在T细胞功能发挥中的作用可以极大的帮助人们更好的理解T细胞，从而促进开发创新的免疫细胞疗法，如以CAR-T为代表的工程化T细胞疗法，攻克免疫细胞疗法目前面临的瓶颈。基因敲除（Knockout）是十分常用的方法研究靶基因在T细胞功能中发挥的作用。然而目前获得靶基因，尤其是表达在细胞内的靶基因，双等位基因完全敲除的原代人T细胞方法十分有限或者过程繁琐，限制了对靶基因在原代人T细胞中的深入研究。

基于敲入等位基因不同蛋白标记物的思路，作者给出了两套敲入DNA的结构设计，适用于不同的应用场景。一套是基于自剪切肽序列P2A结构设计，另一套是基于过表达蛋白标记物。基于P2A的结构设计，蛋白标记物的表达受控于内源启动子。蛋白标记物的表达含量和表达过程收到内源启动子的调控，反映靶基因的表达模式。而基于过表达蛋白标记物的结构设计，可以排除内源启动子的干扰，蛋白标记物过表达，易于后期标记的T细胞筛选，适用于内源启动子低表达的情况。在实际运用中，作者在CAR结构里加入不同的标记序列，如Myc和His，通过一步敲入CAR-Myc和CAR-His，靶基因双等位基因敲除的T细胞将同时表达有CAR-Myc和CAR-His双基因，并同时获得靶基因LCK双等位基因敲除的CAR-T细胞。

图1 插入标记蛋白的两种DNA序列结构设计

在获得双标记的T细胞后，作者通过引入饲养细胞（Feeder cells），即外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC）来扩增双标记的T细胞建立克隆。通过细胞分选和饲养细胞的二次扩增即可获得高含量的双标记T细胞克隆。扩增后的T细胞克隆可以分装冻存在液氮中，可在后续需要的时候取出解冻复苏并再次用饲养细胞进行扩增。扩增可以循环进行多次。双标记的T细胞群也可进行单细胞筛选，并用饲养细胞进行扩增，获得更为统一的克隆系进行后续研究。获得T细胞克隆后，可对T细胞克隆进行靶基因表达验证。在插入位点前后设计引物进行PCR，可以在DNA水平上验证是否具有脱靶效应，并确证标记蛋白基因正确插入目标靶基因序列。通过Western blot可以检测靶基因蛋白是否完全清除。

图2 插入不同标记蛋白后对双等位基因敲除的T细胞克隆筛选扩增及鉴定方法

作者提出的双标记蛋白制备靶基因双等位基因敲除的方法简捷有效，前后流程总花费时长在1个月内。制备完成后的T细胞克隆可分装长期存储于液氮，在需要时取出复苏进行相关实验。不过作者也提出该方法目前的局限性在于双标记敲入的效率低，需使用饲养细胞的持续扩增。扩增后的原代T细胞可能改变其免疫形态（Immunophenotype），比如体内的持久性和记忆性，因此T细胞克隆主要适用于体外的功能性实验，如细胞信号通路激活等相关研究。

图3 制备靶基因双等位基因敲除的T细胞克隆的方法流程

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，作者提出了一种简捷有效的方法快速的制备靶基因双等位基因敲除的原代人T细胞克隆，并详细介绍了制备过程中的要点。值得注意的是，在实际使用中作者用CAR-Myc和CAR-His作为双标记筛选双等位基因敲除的T细胞，在敲除靶基因的同时制备CAR-T细胞。除了用CAR作为标记蛋白以外，其他的功能性蛋白也可以考虑使用，比如TCR或者荧光蛋白。因此在敲除靶基因的同时，也能赋予筛选T细胞其他的设计功能。因此，该方法为研究目标靶基因在T细胞功能中的作用具有十分重要的意义。