mRNA于1961年被发现，然而，直到1989年才提出mRNA作为药物的构思。在这近30年的时间，mRNA的发展历经曲折。主要是由于mRNA不稳定、天然免疫原性高和体内传递效率低等因素导致mRNA应用到临床上受到阻碍。近些年，mRNA的修饰技术和递送技术的不断成熟，以及突如其来的新冠疫情加速了mRNA技术的发展。mRNA是通过体外转录（IVT）得到的，可以在无细胞环境中大量生成。与传统疫苗相比，mRNA因其安全有效、生产工艺简单、能快速应对突变毒株等优点，备受科研人员的青睐。
mRNA在RNA疫苗、基因编辑、多能干细胞的生成以及基于RNA扩增的诊断技术的开发等领域具有较大的应用潜力。
mRNA的结构
真核细胞中一个成熟的mRNA主要包括五个部分，依次为5’帽子、5’非编码区（UTR）、开放阅读框（ORF）、3’非编码区（UTR）和3’端polyA，其中ORF是主体序列。
mRNA结构示意图
5’ cap：在mRNA成熟、剪接、翻译和无义介导的降解中起着至关重要的作用。5’帽子通过募集翻译起始因子4E（EIF4E）参与翻译过程，也通过与DCP1 / DCP2结合调节mRNA的降解。根据甲基化程度不同可分为3种类型的帽子：cap0，cap1和cap2。
帽子结构示意图
UTR：mRNA中的5'-和3'-UTR为非编码区，负责调控mRNA的翻译和稳定性。
ORF：通过密码子的优化、修饰核苷酸的替换等可增强mRNA的稳定性和翻译效率，同时减少固有免疫反应。
3’ polyA尾：mRNA 3’端有一段多聚腺苷酸尾，称Poly A尾，调节mRNA稳定性和翻译效率。研究表明，将含较长的polyA尾的mRNA转染到不同类型的细胞中，蛋白表达量都会增加，长度一般120-150bp较好，过长或过短都会影响mRNA的稳定性和翻译效率。
mRNA生产流程
mRNA体外合成需要多个步骤，包括基因合成、质粒制备、质粒线性化、体外转录，纯化和QC等。
RNA体外转录生产流程
制备高质量的转录模板
制备高质量的转录模板是非常关键的一步，它会影响IVT RNA的产量和RNA的完整性。线性化质粒、PCR产物均可作为转录模板：由于T7 RNA Polymerase具有很高的持续合成活性，环状质粒会转录出不同长度的RNA产物，为了产生特定长度的RNA转录产物，质粒必须充分线性化，线性化的质粒确保双链为平末端或5’端突出(5’ overhang)；带有T7 Promoter的PCR产物作为转录的模板，需要电泳确认产物的单一性。
体外转录mRNA
RNA体外转录（IVT）主要是利用含有T7（TAATACGACTCACTATAGGG），T3（AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA）或者SP6启动子（ATTTAGGTGACACTATAG）序列的DNA为模板在含有T7、T3或SP6 RNA聚合酶的条件下，以NTP或者修饰碱基为底物合成与模板DNA中一条链互补的mRNA，简单快速获得大量的mRNA分子，通过在5’端加上帽子结构和3’端加ployA尾加强mRNA的稳定性。
1. mRNA的加帽工艺
目前加帽方式有2种：酶法加帽和共转录加帽。
酶法加帽，常用的是牛痘病毒加帽系统，该系统包含RNA三磷酸酶、鸟嘌呤甲基转移酶及鸟嘌呤转移酶、甲基供体SAM、GTP和反应buffer。此反应将Cap 0转化为Cap 1，加帽效率接近100%，但需要优化酶反应体系，mRNA制备工艺繁琐，短期内不利于工业化生产。
共转录加帽：在体外转录反应体系中添加帽类似物，实现了一步法加帽，简化了工艺流程。目前常用的帽类似物有两种ARCA和Cap1帽类似物，加帽率可达到95%以上。ARCA共转录产生的是cap0帽子，和天然帽子结构不同，具有较高的免疫原性，并且产量较低，而cap1的帽子结构和天然帽子结构一致，免疫原性低，并且转录产物的产量比较高，逐渐成为新一代的加帽技术。
2. mRNA的核苷酸修饰
IVT mRNA作为外源物质可以被机体中的Toll样受体识别，引发炎症反应。掺入修饰的核苷酸后，可以使 IVT RNA伪装成内源性的RNA，逃避天然免疫反应的受体识别，从而减弱固有免疫反应。
迄今为止，已有多种修饰技术用于生产更稳定的mRNA，降低免疫原性而对其翻译不会产生影响。mRNA常用的修饰核苷酸：N6-甲基腺苷（m6A），5-甲基胞嘧啶核苷（m5C），5-甲氧基尿苷（5moU），假尿苷（ψ）或N1-甲基假尿苷（m1ψ）等；
用修饰的核苷酸替代天然的核苷酸，在一定程度上会影响IVT mRNA的产量，如何得到足够的mRNA用于下游研究呢？安升达经过转录体系的优化，能提供多种核苷酸修饰的IVT mRNA定制服务。
3. mRNA的加尾工艺
mRNA 3´端有一段多聚腺苷酸尾，称Poly A尾，mRNA加尾方式有两种：通过在转录模板中设计编码特定长度的PolyA序列，经体外转录生成，可以得到固定长度的Poly A尾；转录后通过Poly A聚合酶进行加尾，但是Poly A尾长度无法控制，此方法受温度和时间影响，RNA易降解，需计算RNA与ATP的比例。
mRNA的纯化
因杂质含量会影响mRNA的翻译效率，并增加mRNA的免疫原性。IVT得到的mRNA，需要除去酶、游离核苷酸、残留 DNA和dsRNA。目前主要的mRNA纯化技术有：LiCl沉淀、磁珠纯化和层析纯化，可有效去除mRNA制备过程产生的各种杂质。
IVT mRNA的质控
IVT mRNA的生产过程经过多个步骤。为保证产品的质量，需要做检测RNA的完整度和纯度。mRNA行业内常规质控主要通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整度和纯度，如果对mRNA质量有更高的要求，还可以做一些额外的检测，比如加帽效率，polyA长度，dsRNA含量以及蛋白残留等项目的检测。
安升达RNA生产平台有完善的质量分析和质量控制平台，确保交付高质量的RNA产品。
总结
通过体外转录制备的RNA，在机体内短暂的表达靶标蛋白，与DNA或者病毒介导的基因递送系统相比，无插入风险，更加安全。体外合成的RNA具有不稳定性和免疫原性，可以通过加帽加尾和UTR修饰增加mRNA的稳定性，同时添加修饰核苷酸来伪装成内源性的mRNA减弱免疫原性，并对体外转录产物进行质控，以获得质量合格的mRNA产品，用于下游研究。
