生物发光法，无需洗涤流程的FcγR结合检测的开发引导抗体治疗的研发
治疗性抗体和Fc融合蛋白对多种疾病有效，因为它们在与抗原结合方面具有独特的特异性，并能够通过效应功能激活免疫应答，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)。当抗体Fc结构域与免疫效应细胞(如天然杀伤细胞和巨噬细胞)上的Fcγ受体相互作用时，该效应功能被触发。多种因素都会影响Fc结构域和Fcγ受体的相互作用，对这些相互作用进行仔细的优化和监测对维持抗体药物的有效性和安全性是必要的。一种用来检测和比较Fcγ受体对IgG Fc结构域的亲和力的易于使用的，可靠的，高通量的筛选方法将在抗体开发、生产和加工过程中发挥重要的作用。
为了满足检测方法的可靠性和易用性，我们开发了一套针对以下受体的生物发光的生化检测方法：
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Lumit™ FcγRI Binding Immunoassay
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Lumit™ FcγRIIA(H131) Binding Immunoassay
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Lumit™ FcγRIIA(R131) Binding Immunoassay
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Lumit™ FcγRIIIA(V158) Binding Immunoassay
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Lumit™ FcγRIIIA(F158) Binding Immunoassay
这些检测方法是均质型的，这就意味着不需要固定或洗涤步骤。此外，他们是快速，易于使用的96孔板检测形式，只需要一个简单的化学发光检测仪。这些检测可以帮助我们更好地了解抗体MOA，从而发现更好的治疗方法。
Lumit™ 检测方法优势：
Promega开发了基于检测生物发光信号的均质型免疫检测平台(Lumit™)研究FcγR-Ab相互作用。
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Lumit™ 检测方法可用于FcγRI，FcγRIIa (H131 和 R131)，和FcγRIIIa (V158 和F158)；
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该检测方法无需固定和洗涤流程(传统的基于生物传感器的平台，如SPR， BLI需要固定和洗涤步骤)；
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均质型检测，简单快速(30-60min)；
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检测只需要简单的化学发光检测仪；
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该检测兼容384-孔板模式；
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生物发光检测提供了广泛的检测窗口。
Lumit™ FcγR Binding immunoassays，当与生物发光法的Fc Effector Reporter Bioassays联合使用时，将有助于阐明和表征抗体MOA。
01Lumit™ FcγR Binding Immunoassays
Lumit™ FcγR Binding Immunoassays是基于NanoBiT® 蛋白互补技术的竞争性结合免疫检测。
Lumit™ FcγR Binding Immunoassays的试剂盒组分包括：
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Control Antibody
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Tracer-LgBiT
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FcγR-SmBiT
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Lumit™ Detection Substrate
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FcR Assay Buffer
简单的“加样-读数”流程：
02Lumit™ FcγRI Binding Immunoassay
FcγRI是一个高亲和力的受体，有3个Ig类似的胞外结构域。主要与单体IgG结合。
结合亲和力：IgG3 > IgG1 > IgG4 >>> IgG2
03Lumit™ FcγRIIa-H131和-R131 Binding Immunoassays
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编码FcγRIIa的两个等位基因产生两种亚型：H131和R131；
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当IgG与由巨噬细胞表达的FcγRIIa和FcγRI结合时，抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP）被触发。
对于FcγRIIa-H131和-R131来说，
结合亲和力都是：IgG3 > IgG1 > IgG2 和 IgG4
04Lumit™ FcγRIIIa-V158和-F158 Binding Immunoassays
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编码FcγRIIIa的两个等位基因产生两种亚型：V158和F158；
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当抗体与NK细胞表达的FcγRIIIa受体结合时，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）被触发。
对于FcγRIIIa-V158和-F158来说，
结合亲和力都是：IgG1 > IgG3 >>> IgG2 和IgG4
05Lumit™ FcγR Binding Immunoassays用于抗体糖基化检测的灵敏度高
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N297位点发生N-糖基化的IgG1分子示意图。糖基可以通过葡萄糖苷酶和抗体工程化方法进行修饰。
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这些修饰能够调节抗体和多种FcγR之间的相互作用，随后影响效应功能。
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去糖基化能显著降低人IgG与FcγRI的结合，如文献报道。
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去除海藻糖可以提高与FcγR的结合。
06糖修饰对FcγRIIa和FcγRIIIa结合的影响
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去糖基化抗体(绿色)显示结合能力显著降低，正如预期的那样。
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与FcγRIIa相比，去除海藻糖提高了抗体与FcγRIIIa的结合。
07Lumit™ FcγR Binding Immunoassays
检测抗体效能
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使用Lumit™ FcγR (V158) Binding Immunoassay检测曲妥珠单抗的相对效能， 获得了预期的IC50值变化。
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使用所有的Lumit™FcγR Binding immunoassays对抗体效能进行类似的检测(数据未显示)。
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针对FcγR的一组易于使用的效价试验可用于阐明抗体药物的生物活性。
