1. 引言
KRAS是各类癌症中最常发生突变的一类致癌基因。在没有发现靶向KRAS（G12C）肿瘤蛋白的Switch II（SII）口袋的共价配体（例如Sotorasib（AMG510）和Adagrasib（MRTX849））之前，KRAS一直以来被认为是不可成药靶点。KRAS（G12C）是众多KRAS癌蛋白中独特的存在，因为其SII口袋中的亲核突变体半胱氨酸残基可以使用共价药物化学靶向，并且与这些配体发生结合的肿瘤蛋白普遍处于非活性GDP状态。其他KRAS突变（例如G12、G13和Q61热点突变）仍然属于较难进行靶向的靶点，造成这一情况的原因可能是目前缺乏高通量、且具有良好兼容性KRAS结合检测试剂，以及缺乏可对细胞膜定位KRAS靶点结合（TE）进行测定的相应生物物理检测方法，膜定位的KRAS可能与纯化的结构域或KRAS的表现有所不同。
为满足这一需求，我们利用了NanoBRETTM TE方法的检测原理。NanoBRETTM TE是首个利用生物发光共振能量转移（BRET）原理实现对活细胞内特定靶蛋白化合物占有率和效价进行定量测定的生物物理检测方法。迄今为止，该检测方法已在至少13种其他蛋白质类别中进行了成功使用。在本文中，我们提出了一种经过适当改良的NanoBRETTM TE检测方法，该方法使用分裂萤光素酶从而实现对蛋白复合物中的特定TE进行检测。结合基于泛RAS探针BI-2852设计的BRET示踪剂，在本文中我们报告了首个使用NanoBRETTM TE检测法对活细胞中的全长、多聚RAS变体进行测定的实验。这些检测法可对现有KRAS（G12C）抑制剂的药理学作用机制进行准确报告，同时其还可揭示多种RAS变体对特定药物化学型在SII口袋中发生可逆性结合的惊人脆弱性。
2. 使用NanoBRET的靶点结合（TE）
检测原理
● BRET检测原理为NanoLuc®萤光素酶与细胞渗透性荧光示踪剂（其可与NanoLuc® 靶融合蛋白发生结合）之间发生的发光能量转移。
● NanoBRETTM Target Engagement（TE）检测法利用BRET检测原理在多孔板中定量测定化合物与活细胞中靶蛋白的结合亲和力。使用可对BRET信号进行标准化测定的对照实现对化合物占有率的定量测定。
● 由于BRET检测法通过对能量供体（NanoLuc®）与能量受体（示踪剂）之间的紧密距离限制进行检测，因此NanoBRETTM TE检测法可对与NanoLuc® 融合的靶标进行特异性测定。
优势及应用：
可在活细胞中对全长、膜定位RAS进行靶点结合测定。
● 该检测法可对KRAS、HRAS和多种临床相关热点突变进行高质量测定。
● 可对具有多种结合机制的配体（包括SII口袋和SI/II口袋结合剂）进行检测。
● 可对＞5个数量级的效价进行测定。
● 可扩展至384孔板模式，并用于筛选用途。
3. 应用数据示例
01在活细胞中测定多聚体、膜定位RAS复合物的TE
A). NanoBRET RAS TE检测法示意图。使用分裂萤光素酶（NanoBiT）法在HEK293细胞的膜定位RAS多聚体条件下形成萤光素酶供体。细胞渗透性RAS BRET示踪剂发生结合可产生BRET报告信号，RAS配体与示踪剂竞争破坏BRET信号。
B). RAS BRET示踪剂基于SI/II口袋配体BI-2852予以开发，BI-2852是一种混杂性RAS配体，其可与RAS的GDP和GTP结合状态结合。对两个位点进行了相关研究以实现荧光基团连接。
02测定多个RAS结合位点（包括SII和SI/II口袋）的TE
A). 对于SI/II口袋配体（例如BI-2852和前体片段），可以观察到正构靶点结合。
B). 可以观察到SII口袋的变构靶点结合，其效价值与表型检测（例如检测KRAS（G12C）驱动细胞系中的p-ERK抑制）所获得的效价结果之间密切相关。
03SII口袋配体在多种RAS变体中的分析选择性
RAS TE检测法可对多种RAS变体进行检测，包括KRAS WT、HRAS WT和热点突变（例如KRAS G12、Q61和G13），因此可进行选择性分析。
A). AMG510对KRAS ( G12C )的选择性优于其他KRAS热点突变体和HRAS。
B). MRTX849 显示出令人惊讶的结合谱，而不仅仅是KRAS（G12C）。
04使用MRTX849饱和酰胺类似物确认可逆性SII口袋结合
A). 为研究MRTX849与SII口袋的可逆性结合，我们制备了一系列非亲电类似物。
B). 我们观察到了令人惊讶的结合特征，这些结合特征包括KRAS WT和KRAS热点突变（例如G13D、Q61H和Q61L）的独特脆弱性。
C). 含甲基磺酰胺的CPD14是所制备的一系列类似物中各项性能最优的MRTX849类似物之一，甚至表现出与KRAS（G12C）的适度可逆性结合亲和力。
05MRTX-EX185是一种细胞中的强效KRAS（G12D）抑制剂
A). MRTX-EX185是一种KRAS（G12D）抑制剂，其为最近Mirati Therapeutics公司研发的一项专利（WO 2021/04 1671）。
B). MRTX-EX185对KRAS（G12D）的靶点结合效力与其在KRAS（G12D）驱动细胞中的抗增殖作用相似（SW-1990）。
C). MRTX-EX185以时间依赖性方式强效抑制HEK293细胞中的KRAS（G12D）/CRAF-RBD相互作用。
D). 值得注意的是，MRTX-EX185在细胞的多种RAS变体中显示出强效TE。
06MRTX-EX185和MRTX1133对多种RAS变体的选择性
A). MRTX1133是Mirati Therapeutics公司研发并报告的一种临床KRAS（G12D）抑制剂。
B). 与MRTX-EX185相比，MRTX1133对KRAS（G12D）的TE效力增强18倍，这一结果表明两个额外氟原子具有较高重要性（*）。
C). MRTX1133的选择性特征与MRTX-EX185相似，但MRTX1133对所有RAS变体的效力均增强。
D). MRTX1133可抑制多种KRAS突变驱动谱系（包括KRAS（G12V））中的磷酸化ERK活性。
07结论
KRAS容易发生可逆性SII口袋结合
● MRTX849和非共价类似物在KRAS和热点突变中均表现出TE。
● MRTX-EX185和MRTX1133显示出与其他细胞参数（如抑制效应PPI、抗增殖效力和抑制磷酸化ERK活性等）相关的强效靶点结合效力。
● MRTX1133表现出令人惊讶的选择性特征，这一结果可能表明该化合物还可用于KRAS（G12D）驱动肿瘤之外的其他癌症研究中。
