蛋白互作看起来很简单的实验，但是要选择什么方法，才能快、准、稳地完成？你是不是也常常遇到以下这样的问题？
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我有两个Tag的蛋白，怎么做？
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我有两个Tag free的蛋白，我有特异性的抗体，怎么做？
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我有两个Tag free的蛋白，没有抗体，怎么做？
不用担心，小U这就给你送上全方位的解决方案~
01
有两个Tag的蛋白，怎么做？
HTRF®是领先的TR-FRET（时间分辨荧光共振能量转移）技术。它结合了荧光的灵敏度与FRET（荧光共振能量转移）的同质性质和低时间分辨率的背景。HTRF使用两个荧光团，称为一个供体染料和一个受体染料，当它们相互接近时传递能量。供体源（例如闪光灯或激光）的激发触发向受体的能量转移，受体进而在给定波长发射特定的荧光。这种均相的体系中未结合的抗体不需要分离。受体的荧光发射只有在与供体接近时才能产生。
在HTRF蛋白-蛋白相互作用试验中，一个蛋白（直接或间接）与供体标记，另一个蛋白（直接或间接）与受体标记。当这两种蛋白质相互作用时，供体就会靠近受体。供体的激发将导致与蛋白质结合成正比的信号产生。
图1：HTRF原理和蛋白互作模型
优势
①均相，免洗，操作简单，全程1h；
②低背景；
③高通量，小型化（20μl），96、384孔和1536孔板均能获得稳定信号；
④稳定性高：信号稳定（反复读板，7天稳定），试剂稳定（无需避光）；
⑤高灵活性：标记有Eu/Tb供体和标记有XL665/d2的受体，可以提供8种组合方式，非常灵活。
图2：HTRF技术蛋白互作实验流程
1.1
选择最佳的供体和受体对
我建议尝试所有受体对和供体对的组合，以获得最佳信号窗口的结果。以GST Tag HDM2和6His Tag p53蛋白为例：模型和初始抗体对设计如下图：
图3：GST Tag HDM2和6His Tag p53检测模型
图4：供体和受体组合搭配参考
建议蛋白浓度做3个梯度，图5为布局参考。实验体系为20μl，HDM2和p53蛋白各5μl，检测抗体各5μl，按照图6所示操作。
图5：梯度稀释布局示意
图6：实验流程
本次实验中，anti-6His Tb Gold作为供体和anti-GST d2为受体的组合可以获得最大信噪比可作为首选配对抗体。其次是anti-6His Tb Gold作为供体和anti-GST XL665作为备选。
图7：anti-6His Tb Gold作为供体和anti-GST d2作为首选配对抗体
1.2
优化蛋白浓度
选择上述确定的标记抗体，对蛋白进行梯度检测，蛋白浓度可设置依次为：300nM，100nM，33nM，11nM，3.7nM，1.2nM和0.4nM。最佳浓度为100nM 6His-p53, 33nM GST-HDM2。
图8：蛋白浓度数据
那么，抗体浓度呢？若上述实验中所得的信噪比满足实验需求，可不做抗体对优化，如有更高的需求，可参考图9进行抗体浓度的确定。
图9：抗体优化参考
根据以上实验得到相应的数据为，本次实验可选择anti-6His Tb Gold作为供体和anti-GST d2作为受体，蛋白浓度分别是100nM 6His-p53, 33nM GST-HDM2。接下来，就可以继续化合物的筛选工作啦！！！
02
有两个Tag free的蛋白，
有特异性的抗体，怎么做？
我有蛋白，但是蛋白没有标签？也没有生物素化？可以用HTRF技术吗？
当然可以 ！
图10：标记流程简述
我们有标记试剂盒，可以将荧光供体Eu或Tb，荧光受体d2标记到抗体或者蛋白上哦~全程仅需1小时，非常nice...
来源于优宁维药物研发官网
