培养基1：CTS OpTmizer T 细胞扩增 SFM (无酚红)，补充了 2 mM 左旋谷氨酰胺和 2.5% 的含 CTS OpTmizer T 细胞扩增添加剂；4 mM Gibco™ CTS™ GlutaMAX™-I 添加剂和 2.5% 的 CTS™ 免疫细胞血清替代品 (ICSR)。

培养基2：另一供应商的基础培养基，补充了 5% 的人 AB 血清 (hAB)（Gemini 生物制品）和 2 mM Gibco™ 左旋谷氨酰胺 (Thermo Fisher Scientific)。 

G-REX™ 容器 (Wilson Wolf Manufacturing) ：将 5x10⁶ 个 T 细胞接种在了 100 mL 的指定培养基中；

静态板(Fisher Scientific)和 PermaLife™袋 (OriGen Biomedical)：将 T 细胞按 1x10⁶ 个细胞/mL 的浓度接种在了指定培养基中。

在所有实验中，均使用Gibco™Dynabeads™ Human T-Expander CD3/CD28 (Thermo Fisher Scientific) 以每个 T 细胞 3 个磁珠的比率激活 T 细胞，静态培养板和 G-Rex 容器中的实验使用 100 IU/mL 的 rIL-2，培养袋中的实验使用 300 IU/mL 的 rIL-2。

静态培养板和培养袋实验：T 细胞浓度保持在 5 x 10⁵ 个细胞/mL，并在第 3、5、7 和 10 天使用 Vi-CELL TM 分析仪 (Beckman Coulter) 计数

G-Rex 容器实验：在第 5 天和第 7 天更换培养基。

在所有条件下，均在第 3、5 和 7 天使用 100 IU/mL 的 rIL-2 补充培养物。

按照说明在 0-3 天内激活静态 PermaLife 袋中的细胞。第 3 天，将细胞接种到 Thermo Scientific™ HyPerforma™ 摇杆式生物反应器上的 10 L Thermo Scientific™ 摇摆式生物反应器 (BPC) 中。将细胞以 0.25 x 10⁶ 个细胞/mL 的密度接种到含有 100 IU/mL 的 rIL-2 的 1,500 mL 指定扩增培养基中。活细胞密度在第 5 天和第 7 天维持在 0.25 x 10⁶个细胞/mL，直至达到 5 L 的最大体积（rIL-2 随培养基添加）。使用自动气体控制将溶解氧保持在 22%，并通过自动添加碱将 pH 保持在 7 或以上。在整个运行过程中根据培养物的重量自动调整搅拌速度和摇杆角度。每天监测细胞生长和活性，并在第 10 天用流式细胞仪评估表型。

在第 10 天，通过用以下 Invitrogen™ 抗体对 T 细胞进行染色评估了细胞表型： 

Pacific Orange™ CD3、FITC CD4、Pacific Blue™ CD8、eBioscience™ APC CD62L 和 eBioscience™ PE CCR7 (Thermo  Fisher Scientific)。

传统方法中，最常见的 T 细胞扩增和哺乳动物细胞培养容器是静态培养板或烧瓶。图 1 提供的证据表明，CTS OpTmizer T 细胞扩增 SFM（无酚红）（补充了 CTS ICSR 和 CTS GlutaMAX-I 添加剂）与来自另一供应商的含血清培养基（图1A）相比，在静态培养皿中可促进更高水平的细胞生长。此外，所得到的细胞表现出理想的表型，其特征是 CD8+ 细胞与 CD4+ 细胞的比率保持不变（图1B）、有大量的中央记忆细胞和缺乏终末分化细胞，这是通过对 CD3+ 群体中 CD62L 和 CCR7 表达进行测量所得（图1C）。

图 1.静态板中的 T 细胞扩增。在 CTS OpTmizer T 细胞扩增 SFM（无酚红）的静置细胞培养板中对 T 细胞进行了 10 天的培养。(A) 随时间推移测量细胞生长，并以扩增倍数形式进行报告（误差条是每个数据集的标准差）。在第 10 天进行表型鉴定以确定 (B) CD8+ 细胞与 CD4+ 细胞的比率和 (C) 分化程度，这通过 CD3+ 细胞群内的 CD62L 和 CCR7 表达进行测量所得。 这些调查以另一家供应商含 5% hAB 的基础培养基为基准。数据代表三个实验重复项的平均值。

另一种传统的 T 细胞培养容器是静态袋。使用 CTS OpTmizer T 细胞扩增 SFM（无酚红）（补充了 CTS ICSR 和 CTS GlutaMAX-I 添加剂）在袋中进行的 T 细胞扩增与含血清培养方法的结果同样相似（图2A）。两种培养基的 CD8+ 细胞与 CD4+ 细胞的比率（图2B）和分化状态（图2C）也彼此相当。CD8+ 和 CD4+ 细胞的密度均合格，并且细胞朝向分化光谱中央记忆端的分布也适当。

图 2.静态培养袋中的 T 细胞扩增。在 CTS OpTmizer T 细胞扩增 SFM（无酚红）的静置细胞培养袋中对 T 细胞进行了 10 天的培养。(A) 随时间推移测量细胞生长，并以扩增倍数形式进行报告（误差条是每个数据集的标准差）。在第 10 天进行表型鉴定以确定 (B) CD8+ 细胞与 CD4+ 细胞的比率和 (C) 分化程度，这通过 CD3⁺ 细胞群内的 CD62L 和 CCR7 表达进行测量所得。这些调查以另一家供应商含 5% hAB 的基础培养基为基准。数据代表三个实验重复项的平均值。

G-Rex（透气型快速扩增）培养平台已经成为T 细胞扩增首选的静态容器。在 G-Rex 平台上测试了 CTS OpTmizer T 细胞扩增 SFM（无酚红）（使用 CTS ICSR 和 CTS GlutaMAX-I 添加剂进行了补充）的使用，发现它对 T 细胞生长的支持最高可达到与含血清培养基相同的水平（图3A），产生的细胞群表现出预期的 CD8+ 细胞与 CD4+ 细胞比率（图3B），并且与中央记忆表型相关的标记物具有高表达（图3C）。

图3.G-Rex 容器中的 T 细胞扩增。在 CTS OpTmizer T 细胞扩增 SFM（无酚红）的 6 孔 G-Rex 培养容器中对 T 细胞进行了 10 天的培养。(A) 随时间推移测量细胞生长，并以扩增倍数形式进行报告（误差条是每个数据集的标准差）。在第 10 天进行表型鉴定以确定 (B) CD8+ 细胞与 CD4+ 细胞的比率和 (C) 分化程度，这通过 CD3⁺ 细胞群内的 CD62L 和 CCR7 表达进行测量所得。这些调查以另一家供应商含 5% hAB 的基础培养基为基准。数据代表三个实验重复项的平均值。

HyPerforma 摇摆式生物反应器是一种大容量摇摆式生物反应器，能够自动控制气体处理、补料和 pH 值维持。同样，CTS OpTmizer T 细胞扩增 SFM（无酚红）（使用 CTS ICSR 和 CTS GlutaMAX-I 添加剂进行了补充）扩增细胞的效率与含血清培养基相同（图4A）。此外，这些细胞显示的 CD8+ 细胞与 CD4+ 细胞比率与含血清培养基的比率相似（图4B），并且表现出分化标记物的理想分布，其突出特征是效应细胞水平很低（图4C）。

图 4.HyPerforma 摇杆式生物反应器中的 T 细胞扩增。在 PermaLife 静态袋中进行 3 天激活后，在 HyPerforma 摇杆式生物反应器上的 CTS OpTmizer T 细胞扩增 SFM（无酚红）中对 T 细胞进行了培养。DO 和 pH 分别保持在 25% 和 ≥7.00。(A) 随时间推移测量细胞生长情况，并以扩增倍数形式进行了报告。(B) 在第 10 天进行表型鉴定以确定 CD8+ 细胞与 CD4+ 细胞的比率和 (C) 分化程度，这通过 CD3⁺ 细胞群内的 CD62L 和 CCR7 表达进行测量所得。这些调查以另一家供应商含 5% hAB 的基础培养基为基准。

CTS OpTmizer T 细胞扩增 SFM（无酚红）支持在采用不同工作流程的各种培养容器中进行 T 细胞扩增，包括静态培养板、静态培养袋、G-Rex 容器和摇摆式生物反应器。扩增产生的细胞群保持了可接受的 CD8+ 细胞与 CD4+ 细胞比率，并且这些细胞群的特征始终是表达中央记忆标记物的细胞水平较高，表现出终末分化表型的细胞数量很少。