研究背景

胰腺癌(pancreatic cancer,PC)是一种发病隐匿、诊断困难、手术切除率低的高度恶性胃肠肿瘤，已成为世界范围内最常见的致死性疾病之一，其5年生存率仅为8%。因此，迫切需要阐明PC背后的分子和细胞机制，以达到诊断和治疗干预的目的。m6A是真核生物mRNA中含量最多的可逆甲基化修饰，早被证实其参与肿瘤的发生发展，但关于其对于胰腺癌的作用机制尚不明确。作者在这篇文章中重点探讨了m6A去甲基化酶ALKBH5在胰腺癌中的作用。

实验方法主要包括以下5个部分：

图1. m6A去甲基化酶ALKBH5的下调是胰腺癌的特征

作者首先分析了42个PC样本的临床表现（IHC-图1/b，WB-图1/c，RT-qPCR-图1/d），结果发现ALKBH5在PC患者的样本中表达量均低，且这些低表达量的样本中m6A的水平较高。图1/e使用Kaplan-Meier Plotter进行了生存曲线分析，结果显示ALKBH5低表达的患者预后较差。

为了确定ALKBH5依赖的m6A去甲基化的作用，作者分别对敲除/过表达ALKBH5基因的细胞进行了多角度的分析：

图2. ALKBH5对PC细胞的增殖、细胞周期、迁移和侵袭的抑制作用

（1）使用商业化的细胞增值检测盒(CCK-8、EdU)来评估PC细胞的增殖活性（图2/a,e），结果显示ALKBH5的过表达可以显著地减少PC细胞的增殖；利用菌落形成试验（Colony formation assays）也可以观察到ALKBH5的过表达削弱了PC细胞菌落的长期形成，ALKBH5的敲除则呈现了相反的结果；

（2）作者将流式细胞术和WB实验进行结合（图2/g,h），观察到ALKBH5的过表达(Lv-ALKBH5组)导致BxPC-3细胞在G2/M期的百分比显著增加，而ALKBH5的下调(shakbh5组)使得G2/M期细胞数量明显减少；

（3）在单层PC细胞上进行伤口愈合试验和transwell实验分别来评估PC细胞的迁移和侵袭能力（图2/i,j,k,i），结果显示ALKBH5的过表达会抑制PC细胞的这两种能力。

图3. ALKBH5抑制PC模型的肿瘤生长和侵袭潜能

作者接着构建了ALKBH5敲减/过表达的异种移植瘤小鼠模型和原位瘤小鼠模型，通过形态学、IHC和生物发光呈象（BLI）等角度进行了分析。

（1）与低表达ALKBH5的PC组织相比，过表达的肿瘤组织的质量有着明显的下降（图/a,c,d,f）；

（2）免疫组化实验结果显示，ALFBH5过表达会造成ki-67（体内实验中细胞生长的关键指标之一），MMP-2 和 MMP-9的下调，而ALFBH5的敲除则会造成反效果（图/g,h,i,j）;

（3）使用BLI技术在原位瘤小鼠模型中研究发现，植入BxPC-3/Lv-ALKBH5细胞的裸鼠荧光素酶活性明显低于植入BxPC-3/载体细胞的裸鼠；携带SW1990/shALKBH5细胞的小鼠荧光素酶信号明显高于携带SW1990/scramble细胞的小鼠（图/k,l）

为了进一步确认ALKBH5对PC细胞的转录谱是怎么影响的，作者对总共367个差异表达的基因（有204个上调的基因，163个下调的基因）进行了RNA-seq分析。GO和KEGG的结果均表明了，在ALKBH5过表达的PC细胞中，那些会造成细胞凋亡的基因均为上调基因，而那些造成细胞生存和增值的基因为下调基因（图4）。这些结果表明了ALKBH5可能通过影响基因转录参与调节PC。

 图4. ALKBH5对PC细胞转录谱的影响

作者在整体分子水平上对ALKBH5进行了分子调控可能性的分析之后，又进行了m6A-seq的测序，以确定ALKBH5的潜在靶基因。作者总共筛选出了9个高甲基化的靶基因（图5/e），其中发现PER1 mRNA的3 ' -UTR中有一个m6A峰值的富集，该峰值在ALKBH5的过表达降低后减少（图5/f），这暗示了ALKBH5是可能的靶基因。

图5. m6A甲基化是ALKBH5起作用的基础

为了进一步确认PER1是ALKBH5的靶基因，作者对ALKBH5基因进行了敲除和过表达，结果显示敲除后的PC细胞显示低的PER1甲基化水平，而过表达后的PC细胞则显示高的PER1甲基化水平（图6/a）。通过MeRIP-qPCR实验，证明了ALKBH5可调控PER1的mRNA水平及m6A甲基化水平（图6/b）。对PER1进行序列分析后，PER1 mRNA中的m6A修饰位点位于YTHDF2结合位点附近(图5/f)；在敲低YTHDF2后，PC细胞中PER1 mRNA的水平上升(图6/e)。因此，ALKBH5被认为通过消除m6A- YTHDF2依赖的mRNA降解来增加PER1 mRNA水平。

图6. ALKBH5以m6A - YTHDF2依赖的方式增加PER1 mRNA水平

在确定了ALKBH5的靶基因是PER1之后，作者又对PER1的生物学功能进行了分析。

（1）42个临床样本分析发现，PC患者组织中PER1基因有所上调；

（2）通过免疫荧光实验发现，可发现PER1的过表达可以减少因ALKBH5的敲除而引起的细胞形态上的变化，证明了PER1和ALKBH5的表达为正相关（图7/e）；

（3）细胞增值检测盒(CCK-8、EdU)和transwell检测证实，PER1的异位表达抑制了PC的进展，并部分挽救了ALKBH5基因下调后PC细胞增殖和侵袭过程中观察到的异常状态（图7/f,g,h）;

（4）WB实验结果显示，在PER1缺失的前提下（敲除ALKBH5引起的），G2/M期细胞周期阻滞基因的下调和CYCLIN B1的上调，而PER1的过表达部分逆转了这些异常，证实了正常表达的PRE1可以重新激活ATM的相关信号通路（图7/i）；

（5）CoIP实验则进一步证实了PER1和ATM之间的关系（图7/j）

 图7. ALKBH5与PC组织中PER1表达相关，具有抑癌的作用

（1）P53（与ATM相关的基因之一）的异位表达使得PC细胞中ALKBH5的水平有了显著地提高（图8/a,b）；

（2）同时免疫荧光实验结果也显示了P53的表达降低了PC细胞中RNA的甲基化水平（图8/c）；

（3）接着作者设计了两段引物用于覆盖P53两段的结合位点，并在转录了P53基因的PC细胞中进行ChIP实验，发现P53能与两个位点结合，其中绝大多数结合在位点1（图8/e）；

（4）进一步进行荧光素酶的检测发现P53通过野生型启动子刺激ALKBH5的表达，而这种效应则被位点1或位点2的突变所抵消（图8/f,g）。

以上实验均证实了PER1可以通过P53基因来控制ALKBH5的转录

图8. per1通过诱导P53反馈调节ALKBH5的转录